拷贝数变异测序在胎儿先天性心脏病产前遗传学诊断中的应用

【摘要】目的应用拷贝数变异测序(CNV-Seq)技术分析先天性心脏病胎儿基因组拷贝数变异(CNV)，初步探讨CNV-Seq技术在胎儿先天性心脏病产前遗传学诊断中的应用价值。方法选取2017年1月至2017年12月在广西省柳州市妇幼保健院的87例经产前超声诊断为胎儿先天性心脏病的孕妇，行介入性产前诊断，同时进行传统染色体核型分析及CNV-Seq技术分析，相关的CNV到相应的数据库查找，分析CNV表型与基因型的关系。结果两种检查方法共检出染色体畸变18例，检出率为20.7%;其中传统染色体核型分析检出率为12.6%，CNV-Seq技术检出率为17.2%，传统染色体核型分析正常但CNV异常有8例，占9.2%，CNV-Seq技术额外检出了9.2%的染色体畸变。结论染色体畸变是导致胎儿先天性心脏病重要的遗传因素，应用CNV-Seq技术可检测与识别胎儿先天性心脏病亚显微结构的染色体畸变，能发现新的潜在的致病CNV，可作为传统染色体核型分析有效的补充手段。

【关键词】产前诊断；先天性心脏病；二代测序；拷贝数变异

基金项目：广西壮族自治区卫生与计划生育委员会自筹课题(Z20170545)；广西科学研究与技术开发计划项目(1598011-8)；柳州市科学研究与技术开发计划项目(2016G020219)

作者单位：545001广西柳州，柳州市妇幼保健院围产保健科(邓新娥，黄杏玲，王远流，刘百灵)，医学遗传科(唐宁，黄际卫)

Application of copy number variation sequencing in prenatal genetic diagnosis of fetal congenital heart disease

DENG Xin′e, HUANG Xingling, WANG Yuanliu, LIU Bailing, TANG Ning, HUANG Jiwei. Department of perinatal health care, Liuzhou Maternal and Child Health-Care Hospital, Guangxi 545001, China

[Abstract] Objective To analyze the copy number variation (CNV) of fetal genome in congenital heart disease (CHD) by using copy number variation sequencing (CNV Seq), and to explore the application value of CNV SEQ in prenatal genetic diagnosis of CHD. Methods A total of 87 pregnant women with fetal congenital heart disease diagnosed by prenatal ultrasound in Liuzhou Maternal and Child Health Care Hospital of Guangxi Province from January 2017 to December 2017 were selected for interventional prenatal diagnosis. At the same time, traditional karyotype analysis and CNV SEQ technology analysis were carried out. The related CNV was searched in the corresponding database to analyze the relationship between CNV phenotype and genotype. Results 18 cases of the chromosomal aberrations were detected, the detection rate was 20.7%, among which 12.6% (11/87) were detected by traditional karyotype analysis, 17.2% (15/87) by CNV SEQ technology, 8 cases (9.2%) showed normal by traditional karyotype analysis while, it showed abnormal by CNV-seq. Conclusion CNV-seq technology can be used to detect and recognize the chromosomal aberration of fetal CHD submicroscopic structure, find new potential pathogenic CNV, and can be used as an effective complementary means of traditional karyotype analysis.

[Key words] prenatal diagnosis； congenital heart disease； next generation sequencing； copy number variation

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是最常见的出生缺陷，在活产新生儿中的发病率约为0.8%～1.0%,也是1岁以下婴幼儿非感染性死亡的主要病因 [1],中国卫生部门发布的出生缺陷数据表明，CHD占出生缺陷的26.7%[2]。CHD病因包括遗传因素、环境因素或两者兼之，疾病发生发展的病理机制复杂。研究表明，目前能解释的CHD遗传病因不超过30%，而染色体畸变是最常见的遗传病因学之一[3-4]。近十几年来，随着分子遗传检测技术的迅猛发展，如染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis,CMA)、下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术的发展应用，为疾病致病基因组/基因的发现及基因型-表型关联分析提供强有力的工具。本文采用拷贝数变异测序(CNV-Seq)技术对产前超声提示为CHD的胎儿进行染色体核型分析及拷贝数变异(copy number varians,CNV)检测，结合胎儿临床表型分析染色体微缺失或微重复与胎儿CHD的关系，初步探讨CNV-Seq技术在胎儿CHD产前遗传学诊断中的应用价值。

资料与方法

一、资料来源

选取2017年1月～12月于早孕期(11～13+6周)或中孕期(20～28周)在广西省柳州市妇幼保健院进行超声颈项透明层的检查或系统彩超或针对胎儿超声心动图检查等被诊断为胎儿心脏异常伴或不伴心外异常的孕妇共87例。87例孕妇均为单胎妊娠，年龄19～44岁，平均年龄(29.8±5.3)岁；孕周为12～33周，平均孕周(24.1±3.8)周。本研究所有孕妇均进行产前遗传咨询，并被充分告知相关产前遗传学诊断的必要性、局限性及风险，经患者知情同意并签署知情同意书。

二、方法

1.介入性产前诊断：根据患者就诊孕周不同，采用不同的介入性穿刺术,其中绒毛活检5例，羊膜腔穿刺56例，脐血管穿刺26例。所有介入性操作均严格按照产前诊断管理办法中的介入性产前诊断穿刺术[5]常规进行。

2.染色体核型分析：孕10～13+6周的孕妇选择B超引导下经腹绒毛取材，胰酶及胶原酶预处理，接种于绒毛培养基中培养7～9 d；孕16～24周的孕妇则选择羊膜腔穿刺取羊水20 ml，离心收集羊水细胞，接种于羊水培养基中培养7～9 d；对于孕24周以后的孕妇，选择脐带穿刺术，抽取脐静脉血1～1.5 ml，接种于外周血培养基中培养3 d，以G显带染色(必要时加做C显带或N显带)制备染色体标本,每例标本按照ISCN(2016)标准[6],油镜下分析20个分散好、中等长度的中期分裂相,发现嵌合体或异常核型时加数到100个分裂相[4]。

3.高通量测序基因组拷贝数变异分析：(1)提取基因组DNA。基因组 DNA提取使用 QIAGEN公司生产的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行。(2)DNA文库构建。将提取的基因组DNA在超声打断仪上打断成小片段核酸；采用打断后的基因组DNA为起始模板，构建文库，通过PCR扩增的方法进行富集；采用磁珠纯化的方法，对PCR扩增后的 DNA文库进行纯化，从而得到DNA小片段文库。(3)测序。将构建好的DNA文库在IlluminaHi Seq 5000测序平台进行上机测序，最小精度在100 kb，测序深度1X。(4)生物信息学分析。将高通量测序结果经信息分析，将每个测序Reads匹配到其所在的染色体上，做相应标准化Z值分析，通过Z值进行染色体异常判定，然后通过检索UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/)、DECIPHER(http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)、OMIM(http://www.omim.org)、ClinVar(https://www.clinicalgenome.org/data-sharing/clinvar/)、DGV(http://projects.tcag.ca/variation)、PUBMED(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=)等数据库进行CNV临床意义的确定。

4.统计学处理：采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，染色体核型分析检出率与CNV-Seq技术检出率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义

结果

一、传统G显带染色体核型分析

87例孕妇的样本细胞培养均成功，并能发出报告，检出染色体非整倍体或结构重排共有11例,占12.6%(11/87)，其中21-三体2例(图1)，18-三体2例，13-三体1例,X染色体单体1例，1例为未知来源片段插入15q26.3；常见的心脏异常为室间隔缺损，5例合并有心外结构异常，如十二指肠梗阻、唇腭裂，双侧脉络膜丛囊肿、单脐动脉等。另外还检出3例染色体正常变异，其中2例为9号染色体p12q13臂间倒位，1例为15号染色体双随体，1例为22号染色体短臂可能有异染色质。结果见表1。

二、CNV-Seq技术CNV分析

CNV-Seq技术检出染色体畸变为17.2%(15/87)，其中2例21号染色体三拷贝，2例18号染色体三拷贝，1例13号染色体三拷贝，1例X染色体单拷贝，1例6号q23.2远端重复及15号q26.3远端的大片段缺失；另外还检出8例微缺失微重复，片段大小为0.46～5.86 Mb，通过检索UCSC、DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV、PUBMED等数据库进行CNV临床意义确定，其中4例为明确致病性，包括22q11.2微缺失综合征、22q11.2微重复综合征、16p13.3微重复综合征、1q43-44微缺失综合征(图2)；2例临床意义不确定，2例为多态性(良性)。具体结果详见表1。

三、传统G显带染色体核型分析与CNV-Seq技术CNV分析在胎儿心脏发育异常病例中的比较

在87例的胎儿CHD中，两种检查方法共检出染色体畸变18例，检出率为20.7%(18/87)。其中染色体核型分析检出率为12.6%(11/87)，CNV-Seq技术检出率为17.2%(15/87)，染色体核型分析检出率与CNV-Seq技术检出率差异无统计学意义；传统染色体核型分析正常但CNV检出异常有8例(包括致病性、临床意义不明及良性)，占9.2%(8/87)，CNV-Seq技术额外检出了9.2%(8/87)的染色体畸变，但3例染色体核型多态性CNV-Seq分析未能检出。

四、随访结果：电话随访87例胎儿妊娠结局，其中优生引产24例，包括7例染色体核型分析与CNV-Seq分析一致的致病性CNV(见表1中的序号为7、8、11、12、13、14、16的病例)及6例染色体核型正常但CNV异常的胎儿(见表1中的序号为1、3、6、9、10、17的病例)。分娩63例，新生儿一般情况良好，包括2例良性CNV(见表1中的序号为5、15的病例)。

Note:Nindicate that no chromosomal aneuploidy or more than 100 Kb of known CNVs has been detected.

讨论

一、胎儿CHD与染色体畸变的关系

胎儿CHD是一类具有高度异质性的疾病，绝大部分的病因仍未知，染色体畸变是最常见的遗传学病因之一。染色体非整倍体是最早被确认的胎儿CHD 致病原因之一，Chaoui等[7]研究发现，22%胎儿CHD合并有染色体核型异常。CNV是引起复杂性发育畸形的因素，是胎儿CHD发生发展的重要分子病理机制之一。Mademont-Soler等[8]研究发现22q11.2微缺失综合征在胎儿CHD核型结果正常者中占6.4%。Jansen等[9]研究经过排除染色体重排、22q11.2微缺失伴或不伴合并心外畸形的胎儿后，发现在胎儿单一心脏异常中有4.0%致病性CNV及6.0%的临床意义不明变异。Zhu等[10]运用CMA和CNV-Seq技术对115例CHD胎儿的羊水细胞DNA进行检测，发现18.3%胎儿CHD与致病性染色体畸变有关，其中单一的心脏异常占8.2%，心脏合并心外畸形的占28.6%，其中5例CNV与DiGeorge, Wolf-Hirschhorn，Miller-Dieker，Cri-du-chatand Blepharophimosis，Ptosisand Epicanthus Inversus 等综合征相关，还发现4例罕见的致病性CNV。而在本研究中，胎儿CHD的染色体畸变检出率为20.7%，其中传统染色体核型分析检出率为12.6%，CNV-Seq技术检出率为17.2%，传统染色体核型分析正常但CNV异常有8例，占9.2%，CNV-Seq技术额外检出了9.2%的染色体畸变，与相关文献报道相近。因此，对CHD胎儿进行染色体畸变检查有助于对一些遗传性CHD胎儿进行鉴别，为评估胎儿的长期预后提供依据，传统的染色体核型分析方法会导致微缺失微重复的漏诊，造成不良后果，CNV-Seq技术是检测CNV有效途径之一，可作为传统染色体核型分析技术补充方法。

二、CNV-Seq技术在胎儿CHD遗传学诊断中的应用

CMA是一种检测基因组微小变异的有效工具，能同时检测整个基因组亚显微结构的CNV，已被广泛应用于复杂性疾病基因组失衡包括CHD在内的研究中，但CMA通常需要150～250 ng基因组DNA才能满足检测需求，而且价格相对昂贵。NGS是近十年迅速发展起来的一种以高通量、低成本、速度快为主要特征的测序技术，此技术能在一次检测中分析整个基因组范围的CNV及其所影响的基因，并为疾病基因的发现及基因型-表型关联分析提供强有力的工具,越来越广泛的被作为检测基因组失衡(染色体微缺失/微重复)的有效途径之一[11-13]。利用下一代测序的CNV-seq技术可以在全基因组范围内以较高的分辨率检测CNV，与CMA相比可以增加不同的测序深度获得更精确的信息，仅需要50 ng基因组DNA即能完成检测，具有更加灵活、快速、准确、运行成本低等优点,对于产前的珍贵样本检测更具优势。近年来，CNV-Seq技术已开始应用于胎儿CHD遗传学诊断中，Zhu等[10]运用CMA和CNV-Seq两种技术采用盲法进行检测，结果显示CMA与CNV-Seq对CNV的检测敏感性和特异性相当。蔡莉蓉等[14]运用CNV-Seq技术对染色体核型正常的10例CHD胎儿进行遗传学检测，有8例共检测到13处250 kb～13 Mb染色体片段的拷贝数变异，认为CNV-Seq技术用于胎儿CHD遗传分析是可行的。在本研究中，应用CNV-Seq技术在CHD胎儿中检出染色体畸变为17.2%，7例与染色体核型分析结果一致，这7例孕妇均选择了优生引产。另外还检出8例(9.2%)染色体核型正常但CNV结果异常的CHD胎儿，CNV-Seq技术额外检出了9.2%的染色体畸变，其中1例为22q11.2微缺失综合征，1例为22q11.2微重复综合征，1例为16p13.3微重复综合征(OMIM:613458),1例1q43-44微缺失综合征(OMIM:612337)，这些综合征表型具有高度异质性，还可表现为生长发育迟缓、智力障碍、神经系统异常等[7,15-16]；另2例数据库比对结果为临床意义不明变异，其中1例虽然未涉及OMIM致病基因，但是DECIPER数据库有类似病例报道[17]，可表现为发育迟缓、语言发育迟缓、智力低下、手指的短指骨等，而本病例的超声表现为法洛四联症、右位动脉弓。1例16号染色体p13.11处重复1.34 Mb区域，覆盖了16p13.11 recurrent microduplication (neurocognitive disorder susceptibility locus)综合征约90%区域，该综合征所在重复区域为神经认知障碍易感区，临床表现高度异质性，患者可能表现为运动和语言功能发育迟缓、学习障碍、注意缺陷、CHD等[18]，这6例孕妇均经过充分的知情告知情况下选择了终止妊娠。另外，检出了2例良性CNV，这2例良性CNV孕妇及其他未检出已知的明确致病性CNV并选择继续妊娠的孕妇均已分娩，随访出生后的婴儿尚未发现其他伴随症状。研究还发现CNV-Seq技术不能检出染色体平衡重排如9号臂间倒位、双随体等[19]。由此可见，CNV-Seq技术在胎儿CHD遗传病因的研究中是一种有效的检测方法，可检测出全基因组范围100 kb以上的微缺失微重复，可进一步了解胎儿CHD 的遗传学病因及确定胎儿CHD新致病基因，从基因组水平研究其发病机制，为胎儿CHD的预防及干预性治疗奠定基础。但CNV-Seq技术仍然有它的局限性及风险，特别对于CNV结果为临床意义不明的病例，对临床咨询是一个挑战，咨询医师应充分做好孕妇及家属病情告知及检测技术的局限性的告知。

综上所述，染色体畸变是导致胎儿CHD的重要遗传因素，应用CNV-Seq技术可检测与识别胎儿CHD亚显微结构的染色体畸变，能发现新的潜在的致病CNV，可作为传统染色体核型分析方法的有效补充手段，但考虑其局限性及风险，临床咨询医师应充分告知患者检测技术的局限性。

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