既往诸多文献报道，30～35岁以后随着年龄的增加妇女的生育力逐渐下降，在使用辅助生殖技术助孕治疗中，年龄更是影响临床妊娠率的重要因素之一[1]。关于高龄患者年龄的界值，国内大多数研究是以38岁为界[2]，国外有的文献认为女性37岁是临界年龄。不同地区，因环境因素、饮食差异或人们生活水平等因素的不同，高龄界限也因地而异。本文以青海省人民医院就诊的不孕症患者为研究对象，界定了冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)妊娠结局下降的年龄界限，并分析了年龄对FET患者妊娠结局的影响。
对象与方法
一、研究对象
1.选择2014年2月—2017年12月就诊于青海省人民医院生殖医学中心行FET的不孕症患者810例，共825个周期，记录患者年龄及妊娠结局(临床妊娠为阳性)。患者年龄范围21～45岁，平均(33.5±5.0)岁，妊娠404例，妊娠率37.8%。以年龄为横坐标，不同年龄阶层移植人数(左)和妊娠率为纵坐标(右)，绘制年龄-妊娠率曲线图，描述本中心行FET患者的年龄与妊娠率的关系，并通过绘制ROC曲线确定影响妊娠率的年龄节点。
2.选择其中2017年1月—12月的就诊于青海省人民医院生殖医学中心行FET的不孕症患者282例，共282个周期。根据年龄分为<36.5岁组和≥36.5岁组。<36.5岁组患者210例，年龄范围21～36岁，平均(30.0±2.2)岁，≥36.5岁组72例，年龄范围36～45岁，平均(37.0±3.4)岁，比较两组患者的妊娠率、早期流产率及活产率，并进一步采用多元回归分析寻找两组患者FET妊娠结局的影响因素。
3.纳入标准：2014年2月—2017年12月,在本中心行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET )助孕，并保存有卵裂期冻胚的所有患者。
4.排除标准：(1)存在子宫解剖异常、宫腔息肉、子宫内膜结核、子宫内膜炎、输卵管积水等可导致移植失败的患者；(2)排除患有乳腺疾病、激素依赖性肿瘤、不明原因的阴道出血、血栓栓塞疾病等禁用雌激素的患者；(3)排除子宫内膜异位症的患者。
5.卵泡输出率(Follicular output rate，FORT)定义：为B超监测下人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)日16～22 mm卵泡数与自然月经周期第3天3～8 mm窦卵泡数比值[3]。
二、方法
1.子宫内膜准备方案：(1)自然周期。对月经规律、既往有排卵、子宫内膜无损伤的患者应用自然周期方案，于月经第8～9天开始阴道彩超监测卵泡发育和内膜生长情况，当卵泡直径>16 mm时每天测尿黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)值，当尿LH阳性时注射HCG 5000 u诱导排卵，排卵后第1天内膜向分泌期转化，给予地屈孕酮片(达芙通，10毫克/片，荷兰苏威制药公司生产)，每日两次，每次10 mg，联合微粒化黄体酮软胶囊(安琪坦，法杏大药厂，法国，100毫克/粒)，每次200 mg，每日两次，排卵后第3天上午进行FET。当天上午空腹抽取肘静脉血测定雌二醇(estradiol,E2)和孕酮值(progesterone,P)。(2)激素替代周期。对月经不规律、既往无排卵、子宫内膜偏薄(<7 mm)的患者应用激素替代方案(除外说明书中使用激素有禁忌症的患者)，于月经第3天给予口服雌二醇片(2/10 mg,荷兰苏威(上海雅培)制药有限公司)，2 mg/d，根据阴道超声下内膜厚度调整激素用量，每3天逐渐加量，最大可增加至4～6 mg/d，若内膜仍<7 mm则联合给予雌二醇片 [1/10 mg，荷兰苏威(上海雅培)制药有限公司] 0.5/mg，每晚睡前阴道放置，最大可增加至2 mg/d，月经第14～16天阴超监测内膜厚度及形态，若内膜厚度≥8 mm，诱导内膜向分泌期转化，给予雌二醇地屈孕酮片口服 [2/10 mg，荷兰苏威(上海雅培)制药有限公司]，总剂量与内膜转化前服用雌二醇片相同，联合微粒化黄体酮软胶囊阴道给药，每次200 mg，每日两次。若月经第21天内膜仍未达标，则放弃本周期。内膜转化第5天上午行FET，当天上午空腹抽取肘静脉血测定E2和P值。解冻和移植均由副主任医师以上职称大夫操作(移植管型号：T-1821011-S，太平洋康泰科学仪器有限公司)。
2.胚胎质量评级：本实验纳入的胚胎均为D3卵裂期胚胎，胚胎质量评级参考 Brourn Hall Clinic胚胎评分系统[4]。Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形态规则，具有完整的透明带，胞质均匀清晰，胞质没有颗粒现象，碎片0～5%之间；Ⅱ级：卵裂球大小略不均匀，形态欠规则，胞质可有颗粒现象，碎片占6%～20%；Ⅲ级：卵裂球大小明显不均匀，形态明显不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21%～50%；Ⅳ级：卵裂球大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，碎片大于50%。将D3天卵裂球数目≥6个的Ⅰ级和Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎。复苏方法按本中心胚胎培养室玻璃化冷冻复苏的操作常规进行。
3.统计学处理：应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。计数资料用率表示，组间比较用χ2检验，年龄与妊娠率的相关性采用Spearman秩相关分析,并绘制ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)。部分研究对象以妊娠结局为因变量，以年龄、FORT、优质胚胎率、子宫内膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平为自变量进行一般性多元线性回归分析，模型的参数估计采用最小二乘法，衡量每一个自变量对因变量的作用大小，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、FET妊娠率随年龄增长呈下降趋势：随着年龄增长，FET妊娠率逐渐降低，且36岁后下降明显(见图1)，年龄与妊娠率的相关系数为-0.204，有统计学意义。由ROC曲线可知，FET患者年龄与妊娠率的Cut-off值为36.5岁，若≥36.5岁，则妊娠率呈下降趋势(AUC为0.825，灵敏度73.7%，特异度6.4%)(见图2)。
图1 年龄-妊娠率趋势图
Figure 1 Age-pregnancy rate trend chart
图2 年龄与妊娠率的关系
Figure 2 The relationship between age and pregnancy rate
二、不同内膜准备方案对两组患者妊娠率的影响：对于不同年龄组的患者，自然周期及人工周期2种子宫内膜准备方案的妊娠率比较，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 比较不同内膜准备方案对两组患者妊娠率的影响
Table 1 Comparison of pregnancy outcomes of different endometrial preparation schemes(%)
GroupNNaturalcyclepregnancyrate(%)Artificialcyclepregnancyrate(%)Groupof<36.5y21016.6(35/210)83.3(175/210)Groupof≥36.5y7213.9(10/72)86.1(62/72)
三、年龄对FET妊娠结局的影响：<36.5岁组临床妊娠率为51%，≥36.5岁组(33.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)。两组早期流产率和活产率，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 比较不同年龄组患者FET妊娠结局
Table 2 Comparison of FET pregnancy outcomes between different age groups (%)
GroupNClinicalpregnancyrate(%)∗Earlyabortionrate(%)Live-birthrate(%)Groupof<36.5y21051.0(109/210)24.7(27/109)72.4(79/109)Groupof≥36.5y7233.3(24/72) 29.2(7/24) 54.1(13/24)
*P<0.05
四、影响患者不同年龄组FET妊娠结局的因素分析：进一步分析2组患者妊娠结局的影响因素，一般多元线性回归分析发现<36.5岁组患者的年龄、FORT、优质胚胎率、移植日子宫内膜厚度是影响其成功率的主要因素，且移植日子宫内膜厚度是最重要的影响因素，其余依次排序为优质胚胎率、年龄及FORT。移植日雌二醇及孕酮对妊娠结局无影响。而≥36.5岁组患者的年龄、FORT、优质胚胎率、子宫内膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平是影响其成功率的主要因素，年龄为最重要因素，其余依次排序为优质胚胎率、移植日子宫内膜厚度、移植日雌激素水平及孕酮水平、FORT。见表3。
表3 两组患者FET妊娠结局的影响因素
Table 3 Influencing factors of FET pregnancy outcomesbetween the two groups
Factors<36.5y(N=210)Regressioncoefficienttvalues≥36.5y(N=72)RegressioncoefficienttvaluesAge-0.119∗-2.675-0.868∗-3.447FORT0.002∗-1.3190.015∗-2.082Highqualityembryorate0.245∗-2.7310.758∗-2.125Endometrialthickness0.346∗-2.7730.467∗-2.621Estradiol0.002-0.6360.327∗-2.016Progesterone0.212-0.4810.283∗-2.271
*P<0.05
讨 论
由于FET可以通过减少卵巢过度刺激综合征的发生来提高累积妊娠率[5]，并且还能最大限度地减少移植胚胎的个数而成为辅助生殖技术的重要方法。众多研究表明，年龄、优质胚胎率、移植日子宫内膜厚度、卵泡输出率、移植日雌激素和孕激素水平可影响FET妊娠结局。
年龄对FET妊娠结局有较大影响。WANG等[6]研究表明冷冻胚胎的妊娠率随着年龄的增高而下降，特别是>40岁的患者。本研究通过年龄-妊娠趋势图发现，在21～45岁间行FET的患者中，21～30岁妊娠率上升，可达60%～80%。30～36岁虽有波动，但也有较高的妊娠率，达50%～65%。而36岁以后的患者，妊娠率下降。由ROC曲线分析得出，年龄对FET患者妊娠率有预测价值，由软件计算得出，患者妊娠率下降年龄的临界值为36.5岁，曲线下面积为0.825，其95%的近似参考置信区间为(0.720，0.929)，敏感性73.7%，特异性80.4%。因此，本研究将36.5岁作为FET妊娠率下降的高龄界值。进一步行统计分析发现，随着年龄增长，临床妊娠率逐渐下降，早期流产率逐渐增高，活产率逐渐下降(见表1)。年龄<36.5岁组临床妊娠率达51%，年龄≥36.5组临床妊娠率仅为33.3%，差异有统计学意义。与王伟周[7]、马晓娟[8]等研究结果大致相似，但年龄节点略有差异。王伟周等发现40～42岁妇女妊娠率降低。马晓娟等研究发现年龄<35岁组临床妊娠率高于年龄>35岁组。分析可能原因：(1)不同气候的不同地理位置的地区，因新鲜促排周期受精率、卵裂率和胚胎质量等不同，导致FET妊娠率不同。(2)本研究样本量小，仅以2017年度的数据不足以代表整体，需收集更大的数据进行研究证实。本研究回归分析发现，<36.5岁组患者年龄与FET妊娠结局呈负相关，回归系数为0.119。≥36.5组患者年龄与FET妊娠结局也呈负相关，回归系数为0.868。相对而言，年龄对于≥36.5岁组患者妊娠率的影响程度高于<36.5岁组，说明年龄对于高龄和非高龄妇女均有影响，而且对高龄妇女妊娠率的影响程度更大。年龄是无法改变的影响女性生殖能力的重要因素。Gianaroli [9]发现高龄是非整倍体发生的确定因素，非整倍体的异常会造成胚胎着床失败，并致胚停、流产等。本研究发现，两组早期流产率和活产率差异无统计学意义(P>0.05)，考虑与两组样本量小，且样本量悬殊有关系。
卵泡输出率已广泛应用于IVF-ET中卵巢对外源性Gn的反应性及妊娠结局。张宁等[10]研究发现，IVF/ICSI周期中，优质胚胎率、胚胎种植率以及临床妊娠率随着FORT值的升高而逐渐升高，相关分析显示FORT与可移植胚胎数、优质胚胎数呈正相关。从表2可知，FORT与两组患者妊娠率均呈正相关，<36.5岁组回归系数为0.002，≥36.5岁组为0.015，两者相关性相近，考虑FORT对FET患者妊娠结局的预测，仍受年龄影响，由于相关性均很低，说明FORT对不同年龄段FET妊娠结局的预测性差，该指标对ART妊娠结局的预测意义重在新鲜促排卵周期中。
胚胎质量和子宫内膜是影响FET妊娠结局的两大重要因素。子宫内膜容受性是指内膜允许囊胚黏附、穿透并植入从而着床的状态，是胚胎着床的必要条件[11]，是影响FET妊娠结局的重要因素。子宫内膜厚度因其经阴道超声检查简单无创的特点，已成为评价子宫内膜容受性的间接指标之一，为广大学者认可[12]。本研究发现，两组患者优质胚胎率与子宫内膜厚度均与FET妊娠结果呈负相关，<36.5岁组回归系数为0.245，≥36.5岁组为0.758，由此可知，对于36.5岁以上的患者，优质胚胎率和移植日子宫内膜厚度对其成功率的影响更大，与周林燕[13]等研究结果一致。故对于高龄患者，可通过提高优质胚胎的植入率，提高移植日子宫内膜的厚度，从而提高其妊娠结局。
研究发现在胚胎植入过程中适宜雌孕激素水平的协同作用可影响子宫内膜容受性，与种植窗的开闭有关[14]，故是否移植日雌激素及孕激素越高，其妊娠率越高呢？项云改等[15]研究发现，自然周期和激素替代周期妊娠组和未妊娠组移植日雌激素水平均无明显差异，妊娠组的血清P值水平均高于未妊娠组，另观察人工周期FET妊娠率不随E2水平的增高而增加。本研究发现，<36.5岁组患者移植日E2及P水平均与妊娠率无相关性，≥36.5岁组患者移植日E2及P值与妊娠率呈正相关，回归系数分别为0.327、0.283，相关程度较高。由以上结果可推测，E2与P值对FET患者妊娠率的影响与年龄存在相关性，对于高龄女性，E2及P值增加，可增加子宫内膜的厚度及其向分泌期的转化，使子宫内膜的种植窗与胚胎发育同步，有利于胚胎着床。因此，对于高龄女性，应选择激素替代周期，提高体内雌激素及孕激素水平，增加胚胎着床率，提高FET妊娠率。
综上所述，影响FET妊娠结局的因素诸多，且影响程度与年龄呈相关性。对于高龄妇女，年龄是影响其妊娠结局的最重要因素，故在行FET时应根据患者年龄，选择个体化治疗方案，以获得更好的结局。
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