耳聋是一类常见的、难治性的、严重危害人类健康和生活质量的疾病，是我国最常见的出生缺陷之一，新生儿中的发病率达1‰[1,2]，据报道约有60～80%的耳聋与遗传因素有关。其中，GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1是导致遗传性非综合征型耳聋患者最主要的4个致病基因[3]。本文通过直接测序方法对内蒙古地区93例耳聋患者进行耳聋基因(22个基因，159个位点)检测，了解该地区耳聋基因的突变情况。
对象与方法
1.对象
收集2017年11月—2018年5月来自内蒙古自治区妇幼保健院耳鼻喉科及遗传科，呼和浩特市小百灵康复中心和内蒙古自治区残疾人康复服务中心的93例耳聋患者临床资料，有汉族78例，蒙族12例，回族3例。患者均已进行纯音测听，声阻抗和听觉脑干诱发电位等检查，患者纯音电测听结果显示为感音神经性耳聋，同时声阻抗检查结果与纯音电测听检查结果相符；患者均经临床耳轴位CT骨扫描放大及冠状面重建检查。以ABR V波反应阈值>30dBnHL为2～4kHZ范围听力损失的指标，听力损失程度分级标准如下：轻度聋波V反应阈值为31～50dBnHL；中度聋51～70dBnHL；重度聋71～90dBnHL；极重度聋>90dBnHL。本研究经内蒙古自治区妇幼保健院伦理委员会审查批准，所有患者及家庭成员均签署书面知情同意书，未成年人由其监护人代为签署。
排除标准为：除听力下降外，经系统身体检查发现耳、眼等部位先天性畸形者，或伴有其他临床表现的综合征型遗传性耳聋者，以及智力、身体发育异常者。
2.方法
EDTA管采集93例患者及其双亲的外周静脉血3ml，采用联合探针锚定聚合测序法。方法具体为：根据遗传性耳聋基因突变位点序列信息，设计特异性扩增引物，利用多重PCR技术扩增人基因组DNA中靶序列并同时引入用于样本识别的样本标签序列。将多个(≤96个)样本的PCR产物按比例混合成为一个文库样本，经过一系列文库制备过程，每个文库样本中的DNA序列都加上了用于测序及文库识别的接头序列。将适量文库样本按等物质的量比例混合为一个测序样本。BGISEQ-500基因测序仪对测序样本DNA进行序列信息读取，每一条DNA的测序结果经过文库接头序列及样本标签序列比对拆分后将被精确定位到每一个样本中，将每个样本的测序结果与人类基因组比对并对22个耳聋基因的159个突变位点进行数据分析，从而确定159个位点的检测结果。测序数据用遗传性耳聋基因分析软件读取，并将所测序列与NCBI中的基因标准序列进行对比分析，记录序列对比结果。BGISEQ-500基因测序仪由深圳华大基因生物医学工程有限公司生产。
结果
1.检测结果
运用联合探针锚定聚合测序法对93位耳聋患者进行GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体MT-RNR1等22个耳聋致病基因，共159个位点的检测，同时对其双亲采用同样方法进行检测以验证。基因诊断结果显示：52例患者检测发现基因突变。其中37例检测到GJB2、SLC26A4基因纯合突变或复合杂合突变；2例MT-RNR1基因突变自先证者的母亲，还有1例MT-RNR1基因突变患者的母亲未采血故无法验证；另有12例GJB2、GJB3、SLC26A4基因单杂合突变患者,突变位点遗传自先证者的父亲或母亲。本次研究未检测到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突变。
2.基因突变热点
GJB2基因的突变热点为c.299-300delAT、c.235delC和c.176-191delGCTGC- AAGAACGTGTG,SLC26A4基因的突变热点为c.919-2A和c.2168A>G，MT-RNR1的基因突变热点为m.1555A>G(见表1)。
表1 93例患者的耳聋基因分型及突变位点
基因名称检测位点阳性例数GJB2c.299-300delAT(热点)+c.299-300delAT(热点)3c.235delC(热点)+c.235delC(热点)6c.176-191delGCTGCAAGAACGTGTG(热点)+c.235delC(热点)3c.176-191delGCTGCAAGAACGTGTG(热点)+c.299-300delAT(热点)2c.299-300delAT(热点)+c.257A>G1c.299-300delAT(热点)+c.508-511dupAACG1c.299-300delAT(热点)+c.235delC(热点)3c.235delC(热点)+c.35dupG1c.235delC(热点)+c.139G>T2c.35G>T1c.235delC(热点)2合计25SLC26A4c.919-2A>G(热点)+c.919-2A>G(热点)4c.2168A>G(热点)+c.2168A>G(热点)1c.919-2A>G(热点)+c.2168A>G(热点)1c.919-2A>G(热点)+c.1226G>A2c.2168A>G(热点)+c.1547dupC2c.919-2A>G(热点)+c.1975G>C(热点)2c.919-2A>G(热点)+c.1336C>T1c.919-2A>G(热点)+c.1174A>T(热点)1c.919-2A>G(热点)+c.2027T>A(热点)1c.919-2A>G(热点)6c.919-2A>G(热点)1合计22GJB3c.538C>T(热点)2MT-RNR1m.961T>C同质突变2m.1555A>G(热点)异质突变0m.1555A>G(热点)同质突变1合计3
3.突变检出相对频率
GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3基因的突变检出率分别为26.9% 、23.7% 、3.2% 和2.2%(见表2)。
表2 93例患者的不同耳聋基因的突变率
基因名称纯合突变(例数)复合杂合突变(例数)单杂合突变(例数)同质突变(例数)异质突变(例数)突变率(%)GJB291330026.9SLC26A451070023.7MT-RNR1000303.2GJB3002002.2合计1423123056.0
4.突变频率在民族中差异
GJB2基因突变与其它基因的突变在汉族和其他少数民族(包括回族和蒙族)之间无统计学意义(P>0.05)(见表3)。
表3 93例患者GJB2基因突变位点与其它基因突变位点的临床比较
基因突变汉族蒙族回族GJB2基因突变2230其它基因突变∗2052
*注：其它基因指SLC26A、4MT-RNR1和GJB3
5.突变遗传规律
表4提示，1例耳聋患者GJB2基因的突变位点为c.35G>T，遗传方式为常染色体显性遗传，该位点遗传自患者的母亲，但其母亲听力正常；1例患者的母亲(耳聋患者)检出与患者相同的GJB2基因纯合突变；检出2例GJB3基因突变，位点为c.538C>T,该位点突变符合常染色体隐性遗传规律；2例患者检出MT-RNR1基因异质突变，均遗自耳聋的母亲，1例患者存在的MT-RNR1基因同质突变，因其母亲无法采血故不能得到验证；还有4例耳聋患者未检测出MT-RNR1基因异质突变，而其父亲均携带该突变。
表4 非综合征型耳聋者部分直系亲属的耳聋基因测序结果
家族姓名性别基因检测结果基因突变名称其它基因型临床诊断遗传方式1先证者男GJB2c.35G>T单杂合突变耳聋常染色体显性遗传母亲女GJB2c.35G>T单杂合突变听力正常2先证者男GJB2c.235delC纯合突变耳聋常染色体隐性遗传母亲女GJB2c.235delC纯合突变耳聋3先证者男MT-RNR1m.961T>C异质突变耳聋母系遗传母亲女MT-RNR1m.961T>C异质突变耳聋4先证者男MT-RNR1m.961T>C异质突变耳聋母系遗传母亲女MT-RNR1m.961T>C异质突变耳聋5父亲男MT-RNR1m.961T>C异质突变听力正常母系遗传6父亲男MT-RNR1m.961T>C异质突变听力正常母系遗传7父亲男MT-RNR1m.961T>C异质突变听力正常母系遗传8父亲男MT-RNR1m.961T>C异质突变听力正常母系遗传9先证者男GJB3c.538C>T单杂合突变耳聋常染色体隐性遗传母亲女GJB3c.538C>T单杂合突变听力正常10先证者男GJB3c.538C>T单杂合突变耳聋常染色体隐性遗传母亲女GJB3c.538C>T单杂合突变听力正常
6.SLC26A4基因突变与前庭导水管的对应关系
本次研究提示15例患者检测到SLC26A4基因突变，包括纯合突变和复合杂合突变，9例患者同时具备大前庭导水管扩大的影像学特征，但其中2例患者无大前庭导水管扩大；7例存在SLC26A4基因单杂合突变的患者中，1例患者有大前庭导水管扩大；另有3例患者大前庭导水管扩大，但没有SLC26A4基因突变(见表5)。
表5 SLC26A4基因突变与前庭导水管的对应关系
前庭导水管SLC26A4基因纯合突变或复合杂合突变单杂合突变无突变正常200扩大913
讨论
1.GJB2基因突变相对频率最高
本次研究通过对93个患者进行耳聋致病基因检测，发现22例患者存在GJB2基因突变(包括纯合突变和复合杂合突变)，15例患者存在SLC26A4基因突变(包括纯合突变和复合杂合突变)，3例患者存在线粒体MT-RNR1基因突变(包括同质突变和异质突变)；另有3例患者存在GJB2基因单杂合突变，7例患者有SLC26A4基因单杂合突变，2例患者有GJB3基因单杂合突变(均符合常染色体隐性遗传方式)。耳聋基因阳性检出率为55.9%。
2.GJB2、SLC26A4、MT-RNR1 和GJB3是本地区的高发耳聋基因
本次研究提供了22个基因、159个位点的检测，患者未检测到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突变，且检出率排序依次为GJB2>SLC26A4>MT-RNR1>GJB3，可见这四大基因突变在内蒙古地区发生频率较高。
3.发现1例GJB2突变遗传自健康母亲的先证者
耳聋患者中，GJB2基因突变常表现为常染色体隐性遗传，此次研究中GJB2基因突变的患者为25例，包括纯合突变、复合杂合突变及单杂合突变，听力学表现为重度至极重度耳聋。本研究检测到1例患者GJB2基因的突变位点为c.35G>T，遗传方式为常染色体显性遗传，该位点遗传自患者的母亲，但其母亲听力正常，关于同样携带，但是致病性不同，可能有三种解释：(1)患者GJB2其他位点或其他基因存在突变；(2)外显不全，或者母亲有其他基因减弱了这个突变的伤害；(3)普遍耳聋基因病变中女性的症状会弱于男性。关于第一种解释，也有可能c.35G>T在这个家系中表现为隐性遗传，患者是复合杂合或双基因致病，如果没有发现其他突变，只有这个突变，那么可能就是这个突变导致的耳聋。这几种是列出的可能性，也可能还有其他原因。此次研究中还检出2例GJB3基因突变，位点为c.538C>T,该位点突变符合常染色体隐性遗传规律，与同期检出的3例GJB2基因单杂合突变患者一样，有待进一步做GJB2或GJB3基因的全序列检测，因为虽然耳聋基因检测为单杂合突变，仍提示可能为遗传性耳聋，不排除患儿有其它未知或罕见的致聋突变基因存在，需进一步明确耳聋原因。
4.多数SLC26A4基因突变先证者存在大前庭导水管扩大的影像学特征
本次研究提示15例患者检测到SLC26A4基因突变，包括纯合突变、复合杂合突变，9例患者同时具备大前庭导水管扩大的影像学特征，但其中2例患者无大前庭导水管扩大；7例存在SLC26A4基因单杂合突变的患者中，1例患者有大前庭导水管扩大，该患者需做SLC26A4基因全测序以明确是否有罕见基因突变；另有3例患者存在大前庭导水管扩大，没有基因突变，与上述具有SLC26A4基因纯合突变或复合杂合突变但没有前庭导水管扩大的2例患者一样，患者需动态监测颞骨CT或核磁的变化以及时了解发病情况，需注意避免剧烈运动、噪音及发热等情况。
5.发现3例先证者及4例听力正常的先证者父亲存在MT-RNR1基因突变
本研究提示：2例患者检出MT-RNR1基因异质突变，均遗传自耳聋的母亲；1例患者存在的MT-RNR1基因同质突变，因其母亲无法采血故不能得到验证；还有4例听力正常者检测出MT-RNR1基因异质突变，均为耳聋患者的父亲，可以通过禁用氨基因糖甙类药物来避免发生耳聋。同质性是指同一细胞或同一组织中所有的mtDNA分子都是一致的，异质性是指同一细胞或同一组织中有两种或两种以上mtDNA共存，一种为野生型，另一种为突变型。
综上所述，遗传因素在非综合征型耳聋的致聋病因中所占比例较高，在呼和浩特及周边地区耳聋基因的研究发现GJB2 235delC 和 SLC26A4 c.919-2A>G 是耳聋基因的高发位点，线粒体 DNA 检出率极低。国内耳聋基因的突变谱与地域分布有一定关系，北方与南方表现出不同的突变位点发生频率不同[4,5]。本次研究未发现不同的耳聋基因突变在民族之间的差异，可能与样本量少有关，也不排除与取样患者地域分布的差异有关，可通过扩大样本分布的范围和数量来观察不同基因突变与民族之间的关系。对于双侧感音神经性聋的患儿家庭及耳聋基因阳性患儿定期进行听力学随访意义重大[6-8]，为防止再生育耳聋子女，对父母双方实施耳聋基因测序是非常必要的。耳聋基因检测可为降低出生缺陷的三级预防提供理论和实践依据[9,10]。
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