N6-甲基腺嘌呤(m6A)是发生于哺乳动物mRNA上最为常见的修饰[1]。m6A高通量测序结果证实超过7 000个人类基因含有m6A，且每2 000个核苷酸中有一个m6A。m6A修饰主要发生于mRNA高度保守的共识序列：RRACH(R = G or A；H = A，C or U)[2]。研究表明，m6A影响mRNA的剪接、运输、翻译和降解，参与脂肪生成、发育、致癌、干细胞再生以及其他生命进程[2]。
AlkB同源蛋白5(AlkB homologue 5，ALKBH5)是目前发现的m6A去甲基化酶之一，在m6A动态调控过程中起到重要作用[3]。ALKBH5属于AlkB家族蛋白成员，具有保守的铁连接区域和α-酮戊二酸作用区域[4]。研究证实ALKBH5与小鼠的生殖密切相关，ALKBH5敲除小鼠mRNA的m6A水平显著上调，并且小鼠睾丸萎缩，精子数目和活动力的下降[5]，但具体发生机制尚不明确。
富含半胱氨酸分泌蛋白2(CRISP2，Cysteine-rich secretory proteins 2)主要存在于哺乳动物雄性生殖系统，且与生殖的不同阶段相关[6]。CRISP2敲除的小鼠精子功能缺陷，导致生殖障碍[7]。β-防御素1(DEFB1，β-defensin 1)广泛分布于机体内，具有抗微生物的活性，抑制DEFB1功能会降低正常精子的活力和杀菌活性[8]。为了探究m6A升高引起的男性弱精症的发病机制，本研究通过敲除和过表达精原细胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，检测m6A和精子功能相关基因CRISP2和DEFB1的表达，从而明确m6A去甲基化酶ALKBH5对小鼠精原细胞(GC-1)功能的影响。
材料与方法
1.材料:研究所需的主要试剂和仪器包括DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)、0.25% 胰蛋白酶(美国Thermo公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、1%双抗(青霉素、链霉素)(美国Gibco公司)、Lipofectamine 3000 (美国Invitrogen公司)、iTaqTM Universal Supermixes (美国BioRad公司)、ALKBH5抗体(中国Proteintech公司)、GAPDH抗体(中国Proteintech公司)、TRIzol (美国Invitrogen公司)、逆转录试剂盒(日本TOYOBO公司)、核酸酶S1(中国Takara公司)、碱性磷酸酶(中国Takara公司)、磷酸二酯酶(中国Sigma-Aldrich公司)、标准品(rA，rU，rC，rG，dA，T，dC，dG，m6A)(中国Sigma-Aldrich公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、低温离心机(美国Beckman公司)、LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)、Hisep C18-T色谱柱 (150 mm×2.1 mm 5 μm，中国韦泰公司)、AB 3200 QTRAP 质谱仪(美国Life Technologie公司)。
2.细胞培养:由本实验室冻存复苏而得的人胚肾细胞HEK293T和小鼠精原细胞(GC-1)于含有10% 胎牛血清和1%双抗DMEM的培养基中，37 ℃、5% CO2进行培养，当细胞生长状态良好并且融合度达到约80% 时，进行细胞传代或继续下列实验。
3.ALKBH5敲除与过表达：利用Lipofectamine 3000将ALKBH5敲除质粒和空载质粒分别与病毒包装质粒共转染HEK293T细胞，48 h后收集含病毒颗粒的细胞培养上清液，浓缩病毒液，用病毒液感染小鼠精原细胞(GC-1)，72 h 后加入2 μg/mL 的嘌呤霉素筛选，将筛选出的细胞扩大培养并收样，设置敲除组sh-ALKBH5和对照组sh-CTL；利用Lipofectamine 3000 将质粒pcDNA3.1-ALKBH5与空载pcDNA3.1分别转染至小鼠精原细胞(GC-1)，48 h后收集转染的细胞，设置过表达组oe-ALKBH5和对照组oe-CTL。
4.RNA提取与逆转录：TRIzol法提取ALKBH5敲除和过表达细胞RNA，方法参照试剂说明书，40 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀，用NanoDrop检测RNA的浓度与纯度。逆转录试剂盒将细胞RNA逆转录为cDNA，方法参照试剂盒说明书。
5.LC-MS/MS检测细胞m6A水平：利用核酸酶S1、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶酶解精子RNA，采用液相色谱与质谱联用系统检测细胞m6A水平。检测方式为多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式，监测离子对(母离子→子离子)分别为：m6A(282.2 →150.1)，rA(268.4 → 136.2),rU(245.4 → 113.1),rC(244.4 → 112.2)，rG(284.5 → 152.2)，dA(252.4 → 136.2)，T(243.3 → 127.2)，dC(228.4 → 112.2)，dG(268.4 → 152.4)。
6.qPCR检测精子功能相关基因的表达水平：qPCR仪检测精子功能相关基因(CRISP2和DEFB1)表达水平，利用β-肌动蛋白(β-ACTIN)基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)基因作为内参基因进行标化，引物如下(5′→3′)：CRISP2上游引物5′-CGGACATTACACTCAG-3′，下游引物5′-TTGTTACCCATAGGAC-3′，DEFB1上游引物5′-CTTTCTCCTGGTGATG-3′，下游引物5′-GTTCCCTGTAGTTTGG-3′，GAPDH上游引物5′-CAGCAACTCCCACTCTTCCAC-3′，下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3′，β-ACTIN上游引物5′-GTACGACCAGAGGCATACA-3′，下游引物5′-AGCACCCTGTGCTGCTCA-3′。
7.蛋白提取与Western 印迹：收集ALKBH5敲除和过表达细胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min。离心收集上清液，加入上样缓冲液煮沸，得到细胞总蛋白样品。采用10% SDS-PAGE 分离胶电泳分离细胞总蛋白，转膜，脱脂奶粉室温封闭1 h后，于4 ℃一抗孵育过夜，TBST 洗脱15 min三次，加入二抗室温孵育2 h，TBST 洗脱15 min三次，显影。以GAPDH 作为内参蛋白。
8.统计学分析：所有数据采用SPSS 19.0进行分析，各组数据采用
表示，各组间差异采用t检验，P<0.05表示具有统计学差异。
结果
1.GC-1细胞的ALKBH5敲除及过表达：通过Western 印迹检测ALKBH5敲除和过表达细胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)的ALKBH5蛋白表达(见图1)，sh-ALKBH5组细胞ALKBH5表达显著低于对照组(sh-CTL)，oe-ALKBH5组细胞ALKBH5表达显著高于对照组(oe-CTL)，表明在GC-1细胞中成功敲除和过表达ALKBH5。
图1 GC-1细胞中敲除和过表达ALKBH5的蛋白表达
2.ALKBH5敲除及过表达细胞m6A含量：LC-MS/MS检测精子RNA的m6A水平，结果表明敲除组sh-ALKBH5的 m6A含量(0.337%±0.011%)明显高于对照组sh-CTL的m6A 含量(0.293%±0.006%)，P=0.004(见图2)；过表达组oe-ALKBH5细胞m6A含量(0.214%±0.011%)明显低于对照组oe-CTL的m6A 含量(0.256%±0.012%)，P=0.028。
图2 ALKBH5敲除及过表达细胞m6A含量
3.ALKBH5敲除及过表达细胞中精子功能相关基因表达：荧光定量PCR检测ALKBH5敲除及过表达细胞中精子功能相关基因CRISP2和DEFB1的表达水平，结果表明敲除ALKBH5，精子功能相关基因CRISP2和DEFB1表达水平下降；过表达ALKBH5，CRISP2和DEFB1表达升高(图3)。
图3 ALKBH5敲除及过表达细胞中精子功能相关基因表达
讨论
m6A是近年来研究比较热门的RNA甲基化修饰，m6A影响mRNA的稳定性和功能，可通过参与mRNA的剪接、转运、加工等过程来影响基因的表达[9]。ALKBH5是具有RNA去甲基化活性的AlkB家族蛋白，在人类细胞系中敲除ALKBH5，不仅会导致总RNA的m6A含量升高，还会促进这些RNA从细胞核向细胞质的运输。此外，ALKBH5还影响RNA的初期合成和剪接效率[9]。本研究敲除和过表达精原细胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，敲除ALKBH5导致m6A水平升高，过表达ALKBH5导致m6A水平降低。由此可见，ALKBH5作为m6A去甲基化酶，在调控GC-1细胞m6A过程中起到重要作用。随后本实验检测了敲减和过表达ALKBH5的精原细胞精子功能相关基因CRISP2和DEFB1的mRNA表达水平，发现ALKBH5抑制CRISP2和DEFB1基因的表达，其可能的机制是ALKBH5促进m6A的去甲基化，从而影响CRISP2和DEFB1基因的稳定表达。
CRISP2是不育相关基因中的潜在候选基因，在弱精子症病人精子中，CRISP2蛋白水平降低，且CRISP2表达的降低与低精子活动度和不正常的精子形态具有相关性[7]。CRISP2敲除小鼠的精子受精能力和Ca2+调控缺陷导致了小鼠的生殖缺陷[7]。DEFB1是首个被证实的β-defensin 家族成员，在不育男性精子中，DEFB1的含量是明显低于正常精子的，且与精子活动度和抗菌活性降低密切相关。DEFB1与趋化因子受体6(chemokine receptor type 6，CCR6)相互作用，促发对精子运动具有重要作用的Ca2+动员，因此在活力异常的男性不育患者中，DEFB1可能具有诊断和治疗潜能[8]。本研究在细胞水平验证了ALKBH5调控的m6A改变会引起CRISP2和DEFB1表达改变，而CRISP2和DEFB1对精子的功能具有重要影响，由此可以推断，m6A去甲基化酶ALKBH5通过影响CRISP2和DEFB1的表达，而影响精子的功能，这可能也是弱精症精子活动度降低的原因之一。
综上所述，本研究通过在小鼠精原细胞GC-1中干扰和过表达ALKBH5，探究ALKBH5调控的m6A修饰对精子功能相关基因的影响，为弱精子症发病机制的研究提供依据，对男性不育的研究具有一定的意义。
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