妇女孕早期炎性标志物NLR与母乳中sIgA的关系

【摘要】目的探讨妇女孕早期中性粒细胞/淋巴细胞比例(NLR)是否会影响产妇成熟乳中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的浓度。方法研究对象来源于2018年6月至2019年6月在北京大学人民医院募集的产妇。产妇就诊当天自行采集母乳，工作人员将样本放入冰箱内-80℃保存。利用膳食频率调查问卷收集产妇哺乳期膳食情况。从孕期营养门诊获取产妇一般情况与孕早期血常规检查结果，计算NLR。使用ELISA方法检测母乳中的sIgA。将NLR、年龄、BMI、母乳天数、产次、早产、生产方式、平均每日蛋白质摄入量、平均每日能量摄入量和体力活动纳入多变量线性回归模型。结果本研究共有206名产妇纳入分析，此次收集的母乳中位天数及四分位数间距[P25，P75]为44.0[42.0，49.0] d，孕早期NLR中位水平为2.9[2.2，3.5]，最小值1.3，最大值6.8；母乳中的sIgA平均浓度为(1 798.1±213.0)μg/ml。NLR、年龄、母乳天数、产次和经能量调整的平均每日蛋白质摄入量是母乳中sIgA浓度的影响因素。NLR每增加1，母乳中的sIgA浓度升高32.6 μg/ml。敏感性分析显示，剔除中性粒细胞和淋巴细胞5%的偏高值后，NLR仍与sIgA浓度呈正相关。结论母体孕早期NLR水平与成熟乳中的sIgA浓度呈正相关。

【关键词】炎症；中性粒细胞/淋巴细胞比例(NLR)；母乳；分泌型免疫球蛋白A(sIgA)

作者单位：100191 北京，北京大学生育健康研究所/国家卫生健康委员会生育健康重点实验室；北京大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系(刘丽军，刘菊芬，杨晨，王琳琳)；北京大学人民医院临床营养科(郭倩颖，崔铭萱，李雪宁，柳鹏)

Relationship between neutrophil to lymphocyte ratio (NLR) in the first trimester and secretory Immunoglobin A (sIgA) in breast milk

LIU Lijun, GUO Qianying, CUI Mingxuan, LIU Jufen, YANG Chen, LI Xuening, LIU Peng, WANG Linlin.

Institute of Reproductive and Child Health/ National Health Commission Key Laboratory of Reproductive Health;Department of Epidemiology and Biostatistics, School of Public Health, Peking University, Beijing 100191, China

[Abstract] Objective To investigate whether the neutrophil-lymphocyte ratio (NLR) in the first trimester is associated with secretory immunoglobulin A (sIgA) in mature breast milk.MethodsSubjects were recruited in Peking University Renmin Hospital from June 2018 to June 2019. Breast milk were collected on the day of outpatient and were stored at -80℃. Dietary frequency questionnaire was used to collect dietary information during lactation. Information on maternal demographic characteristics and blood routine examination in the first trimester was obtained from Nutritional Department. ELISA was used to determine SIgA concentration in breast milk. NLR, age, BMI, lactation stage, parity, preterm birth, mode of delivery, average daily protein intake, average daily energy intake and physical activity were included in the multivariate linear regression model.ResultsA total of 206 pregnant women were included in the analysis. The median and interquartile range [P25, P75] of breast milk days was 44.0[42.0, 49.0] d, and median NLR was 2.9 [2.2, 3.5], with range of 1.3-6.8. The average concentration of sIgA in breast milk was (1 798.1±213.0) μg/ml. SIgA was correlated with NLR, age, breastfeeding days, parity and energy-adjusted daily protein intake. The concentration of sIgA in breast milk increased by 32.6 μ g / ml for each unit increase of NLR. Sensitivity analysis showed that NLR was still positively correlated with SIgA concentration after removing top 5% neutrophils and lymphocytes.ConclusionNLR in first trimester is positively associated with sIgA in mature human milk.

[Key words] inflammation; neutrophil-lymphocyte ratio (NLR); breast milk; secretory Immunoglobin A (sIgA)

母乳成分复杂，不仅可以满足婴儿的营养需求，还可以提供保护成分，以助于婴儿肠道发育和免疫系统发育成熟。母乳中有多种免疫调节成分，这些成分对于婴儿建立先天免疫力和发展适应性免疫力至关重要。另外，它在变态反应的预防或发展中可能也发挥一定作用[1]。其中，分泌性免疫球蛋白(secretory Immunoglobulin A，sIgA)因含量丰富，功能显著而备受关注。当病原体进入母亲的肠道或上呼吸道时，派伊尔氏淋巴结获得病原体，其抗原由M细胞呈递至循环的B细胞，然后再向乳腺上皮细胞的浆膜侧迁移，并产生IgA。随着IgA从乳腺上皮细胞的浆膜侧移至腔(顶)侧，它们被糖基化并复合形成sIgA，并分泌到母乳中[2]。母乳中的sIgA被认为是主要的免疫球蛋白，通过细胞内的中和、病毒排泄和免疫排斥以保护婴儿免受病原体和毒素损害[3]。

母乳中sIgA的浓度可能受早产、感染、妊娠期糖尿病[4-7]等的影响，而这些因素大多与机体炎症状态有关。作为炎症状态的重要指标，中性粒细胞与淋巴细胞比例(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)已被广泛用于妊娠期糖尿病、先兆子痫等的病因探讨[8-9]。妇女孕早期的NLR水平也可能对母乳中的sIgA产生影响。本研究收集了产妇产后42 d左右的成熟乳，并对哺乳期的膳食情况进行调查，同时，收集孕早期血常规检查信息和研究对象一般情况，探讨孕早期炎症状态是否会影响成熟乳中的sIgA浓度。

对象与方法

本研究以2018年6月至2019年6月在北京大学人民医院生产的妇女为研究对象。纳入标准：(1)在北京大学人民医院接受产前检查并生产的健康女性；(2)在产后42 d左右来临床营养科进行营养咨询,当日提供母乳且接受问卷调查。排除标准：(1)孕早期未接受任何检测；(2)收集的母乳量不够；(3)产后感染；(4)患有精神心理疾患和艾滋病、乙肝等传染性疾病。

从募集的母乳库中，本研究最终获得具有成熟乳(≥5 ml)的所有研究对象,共计206例，其中204例接受了孕早期血常规检测。

本研究已获得北京大学人民医院生物医学伦理委员会批准。所有研究对象均经知情同意并签署书面知情同意书。

1.调查内容与方法：产妇知情同意后，从营养门诊采集产妇一般情况，包括出生日期、民族、孕前身高、体重、既往史、孕产史、末次月经、分娩情况、体力活动情况等。

利用食物频率调查问卷(FFQ)[10]调查产妇哺乳期的膳食习惯，对所有产妇进行从产后第一天到采集母乳当日的膳食摄入情况调查。参考中国食物成分表标准版(第六版)，计算调查对象每日营养素平均摄入量[11]。

2.生物标本采集：产妇来营养科就诊当天，自行清洁乳房，手法挤乳为主，采集至少50 ml的母乳，将母乳储存在储奶袋里。若母乳是前一日的，则需由产妇自行将母乳冷冻后带到医院。

医生及工作人员将收集好的母乳贴上标签，准确记录分娩日期、病案号和宝宝性别。采奶后入库待用，冰箱内-80℃储存。

3.实验室检测：使用血液分析仪(日本Sysmex公司，XN9000-B2(2))分析孕早期(小于12周)全血NLR，NLR=中性粒细胞绝对数/淋巴细胞绝对数。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Dogesce公司,DG11718H)检测母乳中的sIgA。将母乳收集到无菌管中，2℃～8℃条件下离心20 min左右(2 000～3 000转/分)。仔细收集上清备用，离心后如有浑浊形成，应再次离心。从室温平衡 20 min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃；设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl；样本孔中加入待测样本 50 μl，空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60 min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μl)，静置 1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次(也可用洗板机洗板)；每孔加入底物 A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液 50 μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

4.质量控制：所有调查人员均经专门的培训，调查人员采用一对一面对面访谈的方式对产妇进行调查，由孕妇本人应答，问卷由调查人员填写。为帮助被调查者更准确的估计食物摄入量，调查人员采用实物模型和食物标准图谱供被调查者参考。问卷的录入采用双人双录入，若两次结果有不一致之处，则会及时与原始问卷进行核对，对错误数据进行修正。

5. 统计学处理：分类变量将采用频数(构成比，%)；连续变量根据数据情况采用平均值、标准差、中位数、四分位区间进行描述，对于服从正态分布的数据，使用均数±标准差来表示，对于不服从正态分布的数据，使用中位数及四分位数[P25，P75]表示；组间差异性检验时，连续变量采用t检验(正态分布和方差齐性)比较两组间计量资料的差异；多组计量资料比较采用方差分析(正态分布和方差齐性)；采用多变量线性回归法分析产妇孕早期NLR与成熟乳中的sIgA浓度之间的关系，纳入方程的变量包括年龄、BMI、母乳天数、产次、早产、生产方式、平均每日蛋白质摄入量、平均每日能量摄入量和体力活动，以P≥0.1作为变量剔除标准。

妊娠期高血压/糖尿病与炎症和母乳中的sIgA相关，为探讨二者关联是否受疾病状态的影响，以是否患有妊娠期高血压/糖尿病进行分层分析。此外，考虑到由于可能的生理性和病理性因素，部分中性粒细胞和淋巴细胞绝对数出现较偏离的异常值，为避免这些异常值对结果产生影响，故进一步进行敏感性分析，去掉孕早期中性粒细胞和淋巴细胞绝对数的5%最高值，再次进行多变量线性回归分析。

使用EpiData 3.1 建立数据库。所有统计分析均采用Stata 14.0软件实现。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、人群特征分布情况

研究对象怀孕时的年龄不服从正态分布，使用中位数和四分位数间距[P25，P75]描述，中位年龄为30.9[28.9，34.0]岁，17.5%(36/206)的人孕前BMI偏高。此次收集的母乳中位天数为44.0[42.0，49.0] d成熟乳。除汉族外，还有6.4%(13/203)的人来自藏族、满族、回族、瑶族和阿昌族。所有研究对象中，有19.9%(41/206)名产妇患有妊娠期高血压或糖尿病。研究对象哺乳期平均每日蛋白质摄入量中位水平为107.4[82.8，124.1] g/d，高于中国营养学会推荐值(80 g/d)[12]；平均每日能量摄入量中位水平为1 960.3[1 602.2，2 325.5] kcal/d。见表1。

28.4%(58/204)的研究对象孕早期中性粒细胞绝对数偏高(大于6.3×109/L)，4.4%(9/204)淋巴细胞绝对数异常(小于1.1×109/L或大于3.2×109/L)。产妇孕早期的NLR中位水平为2.9[2.2, 3.5]，最小值1.3，最大值6.8；当不纳入本研究中患有妊娠期糖尿病与高血压的产妇后，剩余人群的中位NLR为2.8[2.2，3.5]。母乳中的sIgA平均浓度为(1 798.1±213.0)μg/ml。

二、孕早期NLR与母乳中的sIgA的多变量线性回归

采用多变量线性回归，变量筛选选择逐步后退法。模型F=3.09，P=0.004，包含NLR、年龄、体力活动、哺乳天数、产次、每日能量摄入量和每日蛋白质摄入量7个变量的模型具有统计学意义。当NLR增加1时，母乳中的sIgA浓度升高32.6 μg/ml；年龄每增加1岁，sIgA浓度降低7.1 μg/ml；随着母乳天数的增加，sIgA浓度降低(β=-1.4)；经产妇与初产妇相比，其母乳中的sIgA含量增加。见表2。

以是否患有妊娠期高血压或糖尿病对孕早期NLR与母乳中的sIgA之间的关联进行分层分析。患病人群与非患病人群的孕早期NLR中位数分别为3.0[2.2，3.6]和2.6[2.1，3.5]，差异无统计学意义。在患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA浓度升高72.6 μg/ml(P=0.04)；在非患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA浓度升高26.9 μg/ml，但不具有统计学意义(P=0.12)。见表3。

四、敏感性分析

剔除孕早期中性粒细胞和淋巴细胞绝对数的偏高值后，剩余169例，NLR中位数为2.8[2.2，3.5]。模型F=4.01，P<0.01，包含NLR、年龄、体力活动、哺乳天数、产次和每日蛋白质摄入量6个变量的模型具有统计学意义。当NLR增加1时，母乳中的sIgA浓度升高45.4 μg/ml。见表4。

讨论

本研究对产妇成熟乳中的sIgA进行检测，并探讨了产妇孕早期的NLR水平对sIgA浓度的影响。结果显示，在调整了年龄、BMI、母乳天数、产次、早产、生产方式、经能量调整的平均每日蛋白质摄入量后，孕早期妊娠期妇女的炎性水平与42 d成熟乳中的免疫成分sIgA浓度呈正相关, 当NLR增加1时，母乳中的sIgA浓度升高32.6 μg/ml。当剔除中性粒细胞和淋巴细胞5%的偏高值后，孕早期NLR水平与sIgA浓度关系的结论不变。

现有文献中，尚无研究产妇孕早期的NLR水平与母乳sIgA浓度关系的报道。NLR的检测方法简单，计算方便，只需要通过全血细胞分析获得淋巴细胞绝对数与中性粒细胞绝对数，经济高效，是系统炎症的重要指标，目前已被广泛用于炎性疾病、肿瘤、心血管疾病等的预测[13-14]。而本研究第一次提出了孕早期NLR水平是成熟乳中sIgA浓度的影响因素。

以是否患有妊娠期高血压和糖尿病进行分层分析，结果显示，疾病组孕早期NLR水平与母乳中的sIgA浓度关联强度更高(β=72.6),说明患病人群更加敏感。已有研究表明，妊娠期高血压和妊娠期糖尿病受母体炎症状态的影响[8, 15]，而对是否患有妊娠期糖尿病，两组间的母乳sIgA浓度存在差异[6]，因此，炎症、疾病与母乳免疫成分之间可能存在关联，但具体的机制目前尚不清楚。有研究提示，对于妊娠期糖尿病人群，炎症状态可能通过诱发高血糖进而引起B淋巴细胞功能降低来影响sIgA[6]，但更多的大样本人群研究和机制研究有待补充。

炎症对于女性成功繁殖至关重要，从月经周期到怀孕初期以及分娩后期，生育过程的每个步骤都涉及炎症过程，而孕早期处于促炎状态，如IL-8、MCP-1/CCL-2升高[16]。本研究收集的孕早期血常规结果显示，28.4%中性粒细胞绝对数偏高，4.4%淋巴细胞绝对数异常，但目前尚未有研究定论孕产妇的NLR正常参考值范围。Viktoria等对希腊129名孕妇(流产VS正常生产)孕早期的NLR水平进行了统计，结果显示正常生产组孕妇孕早期的NLR为(2.5±1.0)[17]；以色列地区孕早期正常人群为(2.60±1.01)[18]；比利时安特卫普大学医院的138名对照组孕妇20周之前的NLR水平为(3.08±1.07)[19]。当剔除本研究中患有妊娠期合并症的产妇后，剩余人群的中位NLR为2.8[2.2，3.5]，与多数研究相似，这也为中国女性孕早期的NLR水平提供了一个参考。

妇女孕早期炎症状态生理性增高，就母乳中的免疫球蛋白来说是有利的，sIgA浓度升高，将有助于保护婴儿免受病原体和毒素损害。本研究中，母乳中的sIgA平均浓度为(1 798.1±213.0)μg/ml，但是不同地区的研究结果不同。重庆地区产妇产后3 d以后的成熟乳sIgA含量为(1 548.3±1 634.4)μg/ml(ELISA双抗体夹心法)[20]。一项研究调查了河/湖地区、沿海地区和内陆地区产妇母乳中的免疫因子，结果显示，产后28 d母乳中的sIgA中位浓度分别为438[370，667]、511[430，584]和488[384，736] μg/ml[21]。上海某医院产后42 d门诊收集的母乳，-80℃保存24周后，sIgA含量为6 743[3 076，13 239]μg/ml(ELASA法)[22]。对于国外的情况，一项研究收集了91位日本产妇的母乳，结果显示，产后8周母乳中的sIgA浓度为1 084.7 μg/ml(酶免疫法)[23]。

本研究的优势在于补充了孕早期炎症水平与母乳中的免疫成分之间的关系，以往的sIgA相关因素探讨多聚焦于人群特征和产后因素，鲜有关注孕期因素，因此今后的研究可更多的利用孕期信息来探讨其对母乳成分的影响。此外，本研究还调整了膳食因素，进一步控制了混杂，使得二者之间的关联更加准确。膳食调查采用FFQ,能够以相对简单、经济高效且省时的方式评估长期饮食摄入量；估算营养素摄入量时，参考了最新的食物成分表；在考虑疾病的风险时，最基本的关注点是总能量摄入量调整后的营养素摄入量，而不是营养素的绝对摄入量，因此模型同时纳入了总能量摄入量和体力活动。然而，由于缺少吸烟信息，模型中调整的因素不够全面，不过中国女性吸烟并不普遍，对处于孕期和哺乳期的女性更是如此，因此带来的偏倚可能较小。

综上所述，本研究采用NLR作为母体孕早期的炎症状态标志物，发现孕早期NLR水平与成熟乳中的sIgA浓度呈正相关。今后可综合考虑整个孕期的炎症状态，探讨这一复杂的生理现象是如何对母乳中的成分产生影响的。

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妇女孕早期炎性标志物NLR与母乳中sIgA的关系

Relationship between neutrophil to lymphocyte ratio (NLR) in the first trimester and secretory Immunoglobin A (sIgA) in breast milk

对象与方法

结 果

讨 论

结果

讨论