胚胎或胎儿已经死亡且滞留在宫腔内未能及时自然排出的情况在临床上称之为稽留流产(missed abortion，MA)。近些年相关研究[1]认为稽留流产的发病率呈上升趋势，也因此引起临床上的重视。稽留流产病因研究[2]发现，胚胎因素、免疫系统因素、感染等生理因素以及环境、社会等外界因素均可引起稽留流产的发生。有研究[3-4]显示，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)在流产的发生过程中其表达水平显著升高，与流产密切相关。因此，本研究在既往研究基础上比较稽留流产患者与正常对照组流产后绒毛组织中TNF-α、NF-κB表达情况，并探讨其在稽留流产发生中的意义。现报告如下。
对象与方法
1.研究对象：将2016年1月至2017年1月本院收治的30例早期稽留流产患者作为稽留流产组，同期在本院正常妊娠早期妇女30例为正常对照组，两组患者自愿要求终止妊娠。患者年龄为27～31岁，平均年龄(27.9±2.2)岁，平均停经时间(62±6)d；两组患者的一般临床资料无统计学差异，具有可比性。
2.病例纳入排除标准：根据稽留流产诊断标准[3-4]确诊稽留流产者。所有研究对象要求既往月经规律，未放置宫内节育器，无生殖道发育异常、明显感染及重要脏器疾病史，近3个月内未使用过激素类药物、无外伤及毒物放射线接触史。对照组既往无流产、死胎、死产等不良孕产史，无遗传史。所有入选研究对象对本研究知情同意。
3.标本采集：负压吸引术吸出孕囊后，立即分离出绒毛组织，无菌生理盐水冲洗干净，即刻分装于经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理过的2 mL冻存管中，15 min内置于-80 ℃ 超低温冰箱中保存。
4. 实验流程：将获得的绒毛组织使用10%福尔马林溶液充分固定，待静置固定24 h后，对绒毛组织进行脱水、透明处理、浸蜡、包埋等操作，处理所得的组织再制备为蜡块，为下一步免疫组化实验提供准备。
(1)免疫组化实验。经包埋后的组织标本4 μm连续切片6张，参照说明书进行免疫组化实验。各组绒毛组织切片样本在经二甲苯脱蜡后经以下步骤完成染色。①无水乙醇、梯度酒精中依次浸泡5 min，重复2次；②在温度37℃条件下，使用3% H2O2、10 min；③在温度37 ℃条件下，抗原修复液处理10 min；④孵一抗，过夜；⑤在温度37 ℃条件下孵育二抗，共20 min；⑥滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液处理20 min；⑦显色剂混合溶液(6 min)，苏木素(1 min)，流水冲洗至无染色剂；⑧1%盐酸酒精分化、1%胺水蓝化后流水冲洗，逐步；⑨脱水、透明、封片、观察。在染色过程中，步骤①、⑦、⑧完成后应使用流水冲至切片无溶液残留，其余各步骤完成后均使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗5分钟，重复3次；操作步骤⑨时，应注意逐步脱水。
(2)结果判定标准。参照相关文献[5-6]进行实验结果判定：依据细胞浆、细胞核[7]内含黄/棕黄色颗粒者均属于TNF-α表达、NF-κB阳性表达，并通过切片组织染色分值确定阳性强度。
切片组织染紫色，通过OLYMPUS光学显微镜观察细胞染色强度及染色范围，以染色分值进行评价(半定量法)。切片染色强度分为0～3分，分别对应基本不着色、着色较淡、着色相对适中、着色较深。随机选取5个高倍视野，根据其阳性细胞所占视野内细胞的比例计算染色范围，分为0～3分，分别对应的阳性细胞比例为<5%、5%～20%、21%～50%、>50%。细胞的染色范围和染色强度所得分数总和为0～6分，阴性(-)为≤2分，弱阳性(+)为3分，阳性(++)为4～5分，强阳性(+++)为6分，>2分者均定义为阳性。
已知乳腺癌切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
5. 统计学处理：采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量数据用均数±标准差表示，正态分布及方差齐，两组比较采用t 检验；计数资料以率表示，两组比较采用卡方检验。P<0.05为有统计学意义。
结果
1.两组TNF-α在绒毛组织中的表达分析：稽留流产组绒毛组织的TNF-α的表达阳性率为93.3%，而正常对照组仅为10%，两组相比，稽留流产组显著高于正常对照组(P<0.05)。稽留流产组的平均染色分值为(3.2±1.7)，正常对照组的平均染色分值为(1.6±1.0)，两组间差异有统计学意义；见表1。
2. 两组NF-κB在绒毛组织中的表达分析：稽留流产组绒毛组织的NF-κB的表达阳性率为90.0%，而正常对照组仅为16.7%，两组相比，稽留流产组显著高于正常对照组(P<0.05)。稽留流产组的平均染色分值为(3.7±1.7)，正常对照组的平均染色分值为(2.2±1.1)，两组间差异有显著统计学意义；见表2。
讨论
已知MA在一定程度上会导致胎盘组织机化、凝血功能障碍、弥漫性血管内凝血等并发症，甚至会危及患者生命。有研究[8]认为，MA的发生与患者免疫功能密切相关；也有研究[9]显示，感染是影响稽留流产发生的主要病因之一，两者具有较高的相关性。无论是免疫异常或是感染均与炎症密切相关，TNF-α和NF-κB是常见的与炎症相关的细胞因子。TNF-α是由巨噬细胞产生并在生物组织中广泛表达，是一种具有多种生物学活性的细胞因子。研究[10]证实，一定水平的TNF-α可对妊娠期机体产生有利的促胚胎发育作用，同时可以改善孕体能量代谢、维持妊娠，主要因为TNF-α可促进机体内合成更多的孕激素及绒毛组织促性腺激素，其在刺激细胞滋养层生成尿激酶型纤溶酶原激活剂的同时，有利子宫蜕膜组织外基质降解及胎盘植入[11]。而NF-κB是一种核转录因子，主要参与调控机体免疫、炎症、细胞增殖分化及凋亡等相关基因的转录，尤其是免疫与炎症反应。研究[12]显示，妊娠的成功与特异性的下调NF-κB的表达密切相关，NF-κB表达下调可增强妊娠期的免疫抑制，有利于妊娠的顺利进行。而本研究正常对照组TNF-α表达阳性率为10.0%、TNF-α平均染色分值为(1.9±1.0)。而正常对照组的NF-κB的表达阳性率16.7%、平均染色分值(2.2±1.1)，显示对照组机体TNF-α、NF-κB水平的符合机体内代谢需要及水平情况，与张翔等[13]结果相近。
表1 两组TNF-α在绒毛组织中的表达
组别例数表达强度-++++++表达阳性率(%)平均染色分值(x±s)正常对照组302721010.01.6±1.0稽留流产组302291793.3*3.2±1.7*
与正常对照组比较，*P<0.05
表2 两组NF-κB在绒毛组织中的表达
组别例数表达强度-++++++表达阳性率(%)平均染色分值(x±s)正常对照组302532016.72.2±1.1稽留流产组303361890.0*3.7±1.7*
与正常对照组比较，*P<0.05
只有机体免疫功能紊乱、巨噬细胞激活的情况下，才会致使肿瘤坏死因子水平上升。当TNF-α水平过高时，会诱导滋养细胞的凋亡，细胞表面绒毛组织的减少，导致组织水肿、细胞受损。研究发现，在反复自然流产患者的血清及蜕膜组织中，TNF-α的水平均明显升高。而在早期流产的动物研究中也发现，大鼠子宫中的NF-κB的表达显著高于正常妊娠及非妊娠大鼠。因此，MA作为一种特殊的流产类型，患者的TNF-α和NF-κB也可能有升高的趋势，本研究通过对比观察稽留流产早期妊娠妇女与正常早期妊娠妇女流产后绒毛组织中TNF-α和NF-κB表达的情况，以分析TNF-α和NF-Κb在稽留流产的作用机制。
研究结果显示，稽留流产组绒毛组织的TNF-α表达阳性率为93.3%、平均染色分值为(3.2±1.7)，均显著高于正常对照组。而在NF-κB的表达方面，稽留流产组的表达阳性率为90.0%、平均染色分值为(3.7±1.7)，均显著高于正常对照组，这表明在稽留流产患者中确实存在TNF-α和NF-κB表达增高的情况[14]，这是因为正常妊娠者体内一定的TNF-α、NF-κB水平符合机体代谢的需要，观察组TNF-α表达升高，结合患者的病史、孕产史、近期内无外源性致病史，说明其体内存在机体免疫功能紊乱或巨噬细胞激活，观察组TNF-α、NF-κB水平异常，说明其与稽留流产有一定的关系；其免疫功能异常或巨噬细胞激活，孕激素、绒毛组织促性腺激素生成受影响，细胞滋养层对尿激酶型纤溶酶原激活剂的生成功能与正常对照组有异常，影响胚胎或是胎儿的宫内发育；在胚胎或胎儿已经死亡发生时[15]，虽然不能及时确诊，但其滞留在宫腔内，子宫蜕膜组织外基质不能降解，机体内免疫系统对死亡组织的吸收反应导致TNF-α、NF-κB水平进一步紊乱。以上综合说明稽留流产的发生与母体的免疫功能异常或感染引起的炎症相关。
综上所述，稽留流产患者绒毛组织中TNF-α和NF-κB的表达阳性率显著提高，这可能与稽留流产的发生与母体的免疫功能异常或感染引起的炎症相关。
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