随着产科和新生儿重症监护技术的发展，早产儿的存活率明显提高，但早产儿脑损伤(brain injury in premature infants，BIPI)的发生率也随之增加[1]。早产儿脑损伤目前尚无有效的特异治疗，目前重点在积极预防，如不能早期发现及干预，常可引起脑性瘫痪、智力低下，甚至死亡。有研究表明,神经丝蛋白H磷酸化亚型(phosphorylated neurofilament heavy subunit，pNF-H)水平变化与神经轴突损伤有关,可反映神经损伤和再生程度[2]。基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)是一类肽键内切酶，能降解大部分的细胞外基质，破坏血脑屏障，增加脑水肿、细胞凋亡等病理反应[3]。近年来，振幅整合脑电图(amplitude integrated EEG，aEEG)在新生儿重症监护室(NICU)得到越来越广泛地应用，aEEG可以通过检测大脑皮层的电活动来评估脑功能，这对新生儿窒息的治疗和脑损伤的预后有重要价值[4]。本研究旨在通过检测早产儿血浆中pNF-H及MMP-9水平，并联合aEEG检测技术，探讨其对早产儿脑损伤的早期预测价值。
对象与方法
一、对象
1.纳入及排除标准：选择2018年9月至2019年12月收入徐州医科大学附属医院新生儿重症监护室的具有高风险脑损伤的早产儿为研究对象，进行前瞻性的队列研究。研究开始时入选74例早产儿，排除其中死亡4例、放弃治疗 5 例、失访 9 例，剩余56例。入选标准：(1)出生胎龄为<37周，男女不限；(2)存在脑损伤高风险因素，包括以下其中之一：①新生儿生后存在中枢性呼吸暂停或抑制状态、心动过缓、血压波动、意识改变、惊厥、颅内压增高、肌张力异常、原始反射异常等临床表现；②新生儿具有脑缺氧缺血与血流动力学紊乱情况，包括严重宫内窘迫与出生时窒息、高或低碳酸血症等；③新生儿有感染与炎症反应，包括绒毛膜羊膜炎、宫内感染、坏死性小肠结肠炎等；④ 新生儿具有血液系统疾病表现，包括出凝血异常、中-重度贫血、红细胞增多症等；⑤孕母具有产科高危因素，包括血栓或羊水栓塞、孕母合并症/并发症、不良嗜好和异常分娩史等[5]。排除标准：由遗传代谢紊乱、重度高胆红素血症、TORCH、中枢神经系统感染等引起的脑损害，以及有明显染色体疾病和先天畸形患儿。本研究征得患儿家长知情同意，并经本院医学伦理委员会审核通过。
2.早产儿脑损伤的诊断标准：诊断标准参考2012版《中国当代儿科杂志》的《早产儿脑损伤诊断与防治专家共识》[5]，主要依据早产儿头颅影像学检查进行诊断。所有早产儿均在出生3 d 内行首次头颅超声检查，后隔周复查1次，直至出院。对头颅超声未见异常，但疑有颅内病变者行头颅MRI或CT检查，确诊是否存在脑损伤。若头颅影像学检查早期发现严重脑水肿、各种类型的颅内出血、脑梗死、脑白质损伤等改变，晚期发现多囊脑软化、脑空洞、脑穿通畸形、严重脑室扩张或脑积水及脑萎缩等改变时，视为头颅影像学异常[5]。有上述影像学改变情况之一者，纳入脑损伤组。
根据早产儿的头颅影像学检查结果，将56例早产儿分为脑损伤组26例和无脑损伤组30例。其中，头颅超声未见异常，但疑有颅内病变而进行头颅MRI或CT检查的早产儿有10例。怀疑颅内病变的原因：(1)有4例患儿生后6 h行aEEG检测，出现缺乏睡眠周期、窄带下界电压过低、窄带带宽加大、连续性低电压、癫癎样波形和爆发抑制等aEEG异常的表现；(2)有6例患儿出现一些严重的并发症，如严重的呼吸暂停或抑制、呼吸衰竭、高碳酸血症、中-重度贫血、多器官功能损害等。这些患儿多存在严重的呼吸暂停或抑制，惊厥，发应低下、肌张力低下、原始反射减弱或消失等临床表现。
二、方法
1.一般情况：记录早产儿出生时的一般情况，包括性别、胎龄、出生体重、1 min和5 min Apar评分、分娩方式等。
2.血浆pNF-H、MMP-9水平检测：抽取早产儿生后1 d、3 d、7 d的患儿动脉血1.5 mL，使用肝素抗凝管保存，2 h内离心(4℃，3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min)后吸取上层血浆，置于-80 ℃冰箱内保存待测。试剂采用上海雅吉生物科技有限公司诊断试剂，并采用酶联免疫吸附法(ELISA法)进行检测。操作时严格按照试剂盒说明书进行，同时记录各组早产儿不同时间节点血浆pNF-H、MMP-9指标变化情况。
3.振幅整合脑电图检查(aEEG)：早产儿生后6 h进行aEEG检查。检查采用NicoletOne视频脑电监测仪记录脑电图，监测前常规清洁头皮，涂抹导电糊，记录电极为双额、顶骨电极(相当于10/20系统的F3，F4，C3，C4，P3及P4处)，参考电极位于前额中线距头顶中心25 mm处，记录时间为4～6 h。采用 Burdjalov 等创建的 CFM(cerebral function monitor)评分系统[6]对aEEG图形结果进行评分，并由专业医师通过aEEG图形背景活动、睡眠-觉醒周期及是否存在惊厥定性评价早产儿脑发育情况。
4.统计学处理：应用SPSS 24.0统计软件进行数据处理，对于符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；对于不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位间距)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用卡方检验。采用多元Logistic回归分析构建回归方程，得到新变量(联合预测概率)，以新变量为检验变量，诊断结果为因变量，作ROC曲线分析，计算灵敏度、特异度及曲线下面积(AUC)。以P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
在 56例早产儿脑损伤中，44例早产儿(脑损伤组24例，无脑损伤组20例)有临床表现，占78.6%，其中40例早产儿存在呼吸暂停或抑制状态，5例出现心动过缓，9例出现血压波动，12例出现惊厥，7例出现颅内压增高，38例出现反应低下、肌张力低下、原始反射减弱或消失。
一、一般情况
两组早产儿的一般情况，包括性别、胎龄、出生体重、1 min和5 min Apar评分、分娩方式，差异均无统计学意义。见表1。
表1 两组早产儿一般情况比较
Table 1 Comparison of basic characteristics among premature infants by brain injury group
GroupNSex[n(%)]MaleFemaleGestationalage[M(P25～P75),week]Birthweight( x±s,g)Apgarscore[M(P25～P75),score]1min5minDeliverymode[n(%)]CesareanEutociaBIPI2618(69.2)8(30.8)32.6(31.2～34.2)1915.4±499.45.0(5.0～7.0)7.0(7.0～8.0)20(76.9)6(23.1)Non-BIPI3019(63.3)11(36.7)33.3(32.5～34.0)2015.7±446.66.0(5.0～8.0)7.0(7.0～8.0)24(80.0)6(20.0)
二、血浆pNF-H、MMP-9水平变化
脑损伤组早产儿生后1 d、3 d、7 d血浆 pNF-H水平较无脑损伤组均有升高，差异均有统计学意义。脑损伤组血浆 pNF-H 水平在生后3 d时检测浓度最高，后逐渐下降，7 d明显下降并趋于生后1 d的浓度。脑损伤组早产儿生后3 d与生后1 d血浆 pNF-H水平之间比较，差异有统计学意义。见图1。
a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1 after birth，P<0.05
图1 两组早产儿不同时间血浆pNF-H水平比较
Figure 1 Comparison of plasma pNF-H levels among premature infants by brain injury and days after birth
脑损伤组早产儿生后1 d、3 d、7 d血浆 MMP-9水平较无脑损伤组均有升高，差异均有统计学意义。脑损伤组血浆 MMP-9水平在生后3 d时检测浓度最高，后逐渐下降，7 d后明显下降并稍低于生后1 d的浓度。脑损伤组早产儿生后3 d与生后1 d血浆 MMP-9水平比较，差异有统计学意义。见图2。
a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1，P<0.05
图2 两组早产儿不同时间血浆MMP-9水平比较
Figure 2 Comparison of plasma MMP-9 levels among premature infants by brain injury and days after birth
三、振幅整合脑电图检查(aEEG)
26例脑损伤组中aEEG结果异常为20例(76.9%)，30例无脑损伤组中aEEG结果异常为5例(16.7%)，两组差异有统计学意义。脑损伤组aEEG图形的连续性(Cy)、睡眠-觉醒周期(Co)、宽带(B)、总评分(T)均低于无脑损伤组，差异均有统计学意义，两组早产儿aEEG图形的下界振幅(LB)差异无统计学意义。见表2。
表2 脑损伤组与无脑损伤组之间aEEG监测指标比较
Table 2 Comparison of aEEG monitoring indexes between the brain injury group and the non-brain injury group
GroupNCyCoLBBTAbnormal[n(%)]Normal[n(%)]BIPI262.0(1.0～2.0)∗2.5(2.0～3.0)∗2.0(2.0～2.0)2.0(2.0～3.0)∗8.0(7.0～9.3)∗20(76.9)6(23.1)∗Non-BIPI302.0(2.0～2.0)3.0(3.0～4.0)2.0(2.0～2.0)3.0(3.0～3.0)10.0(10.0～11.0)5(16.7)25(83.3)
Compared with the group without brain injury，*P<0.05
四、Logistic回归模型
对生后第3天血浆中pNF-H、MMP-9水平及aEEG等变量行Logistic单因素分析，变量对诊断早产儿脑损伤均为有意义的变量(P<0.05)。故以早产儿脑损伤状态(脑损伤组、无脑损伤组)为因变量，pNF-H、MMP-9及aEEG等检测结果为自变量，采用Forward Condition方法作多元Logistic逐步回归分析，得到回归方程式：Logit(P)=-18.406+0.177×pNF-H+0.132×MMP-9+3.264×aEEG。诊断模型各参数详见表3。
表3 多元Logistic回归分析早产儿脑损伤发生的风险因素
Table 3 Multivariate Logistic regression analysis on risk factors for brain injury in premature infants
VariableBSEWaldOR95%CIPpNF-H(3d)0.180.076.231.191.04～1.37 0.013MMP-9(3d)0.130.055.901.141.03～1.27 0.015aEEG3.261.614.0926.161.10～618.050.043Constant-18.415.7110.380-0.001
五、ROC曲线
以生后第3天血浆pNF-H、MMP-9水平、aEEG结果及三者联合得到的总体预测概率变量为自变量，疾病诊断结果为因变量，绘制ROC曲线，见图3。结果显示，生后3 d血浆pNF-H水平预测早产儿脑损伤的灵敏度80.8%，特异度为90.0%；生后3 d血浆MMP-9水平预测早产儿脑损伤的灵敏度76.9%，特异度为96.7%；生后6 h行aEEG检查预测早产儿脑损伤的灵敏度76.9%，特异度为83.3%；三者联合诊断的AUC显著大于单独检测pNF-H、MMP-9水平及aEEG，达到97.3%，诊断的灵敏度达到96.2%，特异度达到90.0%。见表4。
表4 pNF-H、MMP-9、aEEG单独检测及运用Logstic回归模型诊断早产儿脑损伤的诊断价值(%)
Table 4 pNF-H, MMP-9 and aEEG separately and diagnostic value of brain injury in premature infants using Logistic regression model(%)
IndexpNF-H(3d)MMP-9(3d)aEEG(6h)CombinedSensitivity80.876.976.996.2Specific90.096.783.390.0AUC91.590.580.197.3SE0.0360.0440.0630.018P<0.001<0.001<0.001<0.001
图3 pNF-H、MMP-9、aEEG单独检测及运用Logistic回归模型诊断早产儿脑损伤的ROC曲线
Figure 3 pNF-H, MMP-9, and aEEG separately and ROC Curve for diagnosis of brain injury in premature infants using Logistic regression model
讨 论
早产儿脑损伤是围产期的主要并发症，也是潜在的长期神经发育障碍。有研究表明，早产儿脑损伤与围产期多种因素有关，包括胎龄过低、围产期缺氧、感染/炎症反应、贫血、低血糖以及应用机械通气等，而存活者中多遗留神经系统后遗症，包括脑瘫、视力、听力及学习障碍等问题，严重影响其生命质量[7]。因此，应该综合多种方法，早期识别早产儿脑损伤，寻找针对性的临床干预措施，降低早产儿致残率，减轻社会负担[8]。
神经丝蛋白H(NF-H)是神经丝蛋白的一种亚单位，在维持神经细胞正常形态、轴浆运输等方面发挥着重要作用[9]。NF-H蛋白序列是由以赖氨酸-丝氨酸-脯氨酸(KSP)序列为中心的6～8个连续重复的氨基酸序列组成的。在轴突神经丝中，基本上所有丝氨酸残基都磷酸化，而NF-H的树突和核周形式在这些位点上通常不磷酸化，因此，KSP磷酸化形式是轴突特异性的[10]。众所周知，这种磷酸化形式的NF-H(即pNF-H)比其他神经丝亚单位更能抵抗钙蛋白酶和其他蛋白酶，这表明pNF-H可能是轴突损伤和变性的一个非常好的生物标记物。Douglas等[2]研究发现，缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)患儿血浆中pNF-H明显高于对照组，且血浆pNF-H水平的升高预示着预后不良。Zurek等[11]研究发现，儿童创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后2 d的血浆pNF-H水平达到高峰，伤后7 d降至接近对照水平，中、重度损伤组pNF-H表达明显强于对照组。本研究显示，早产儿脑损伤组早产儿在生后1 d、3 d、7 d血浆pNF-H水平较无脑损伤组显著升高，且在生后3 d时观察到pNF-H水平最高，且生后3 d血浆pNF-H水平预测早产儿脑损伤的灵敏度80.8%，特异度为90.0%。因此，pNF-H可能作为脑损伤的潜在生物学标记物。
基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌依赖性肽键内切酶，能切割细胞外基质，包括基膜的主要成分和内皮细胞之间的紧密连接[12]。特别是基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，也被称为明胶酶B或IV型胶原酶，在脑缺血和炎症时可以被激活，并降解内皮基底膜的IV型胶原，导致血脑屏障的破坏，增加脑水肿、细胞凋亡等病理反应[3]。有研究表明，当早产儿脑损伤发生时，在多种炎症因子、细胞免疫反应的刺激下，MMP-9 表达可在短期内形成瀑布效应，但随患儿病情缓解及在各类临床干预措施对机体的保护作用下，MMP-9 表达也随之降低[13]。Okamoto等[14]研究发现，脑室周围-脑室内出血(periventricular-intraventricular hemorrhage，PVH-IVH)后脑室扩张患儿脑脊液中的MMP-9水平明显高于对照组，并认为MMP-9可以降解广泛沉积在蛛网膜下腔的细胞外基质蛋白，在阻止和解决脑室扩张中起重要作用。本研究显示脑损伤组早产儿在生后1 d、3 d、7 d血浆MMP-9水平较无脑损伤组显著升高，且在生后3 d时检测浓度最高，且生后3 d血浆MMP-9水平预测早产儿脑损伤的灵敏度76.9%，特异度为96.7%。因此生后不久检测早产儿血浆中MMP-9水平有利于早产儿脑损伤的早期预测。
近年来，aEEG在新生儿重症监护室(NICU)中越来越广泛地应用于新生儿脑功能的连续监测。目前，aEEG临床应用的主要领域是足月婴儿出生窒息后脑结局的预测，脑癫痫活动的检测和抗癫痫药物治疗的监测，而在早产儿方面，可以利用Burdjalov评分描述皮层电活动的生理成熟，间接地提供了对病理模式的测量[15]。有研究显示，aEEG低电压、背景活动不连续和缺失成熟的睡眠觉醒周期与早产儿不良预后甚至与死亡有关[16]。此外，早产儿振幅整合脑电图的异常背景活动较影像学表现更早出现，更利于早期诊断早产儿脑损伤。本研究显示，脑损伤组与无脑损伤组中aEEG异常的比例差异有统计学意义，脑损伤组aEEG图形的连续性(Cy)、睡眠-觉醒周期(Co)、宽带(B)、总评分(T)均低于无脑损伤组，差异有统计学意义，生后6 h行aEEG检查预测早产儿脑损伤的灵敏度76.9%，特异度为83.3%，说明 aEEG 可在一定程度上对早产儿脑损伤进行早期预测。
本研究还采用了Logistic回归及ROC来评价pNF-H、MMP-9联合aEEG对早产儿脑损伤的早期预测价值。本研究3项指标的回归分析中比值比(odds ratio，OR)均大于1，提示这些指标升高或异常会增加早产儿脑损伤风险；ROC曲线显示，三者联合诊断的AUC显著大于单独检测pNF-H、MMP-9水平及aEEG，达到97.3%，说明三者联合检测对早产儿脑损伤诊断价值最高；生后3 d血浆pNF-H、MMP-9及aEEG的灵敏度较低，特异度较高，表明其诊断早产儿脑损伤容易漏诊，也就是说假阴性比较高；而三者联合检测的灵敏度明显提高，达到96.2%，特异度也达到90.0%，说明三者联合检测可以显著提高诊断早产儿脑损伤的灵敏度，减少漏诊，从而尽早对脑损伤的早产儿进行干预和治疗。
综上所述，pNF-H、MMP-9联合aEEG对早产儿脑损伤具有早期预测价值。早产儿脑损伤病因复杂，临床上无明显特异性表现，一旦发生无特效治疗，重在预防。因此，需要根据时机合理联合两个或两个以上的诊断方法进行精准和全面的诊断，并尽早对脑损伤的早产儿进行干预及治疗。急性期可以对症处理，包括避免和减少对患儿的不良刺激，优化呼吸管理，维持体温、血压、电解质稳定，积极控制感染及惊厥等；恢复期则以康复治疗为主，以期真正改善早产儿远期神经发育不良的预后。由于本研究样本量较少，随访时间较短，将来有必要进一步研究 pNF-H、MMP-9、aEEG和神经发育预后的关系。
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