栀子黄(gardenia yellow)，主要成分为藏花素和藏花酸，是以栀子果实为原料经乙醇浸提法提取、纯化而成的天然色素[1]。栀子黄色素易溶于水、乙醇等极性溶剂，对金属离子、酸、碱和热等稳定，呈鲜艳的黄色，具有较好的着色性能[2-3]。栀子黄色素在中国和日本等亚洲国家已作为食品添加剂广泛使用。中国《食品安全国家标准——食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)规定栀子黄可用于果汁(味)型饮料、配制酒、糕点上彩妆、冰棍、雪糕、膨化食品、果冻、面饼、糖果和栗子罐头等[4]。
栀子黄色素作为天然食用色素在中国广泛使用，但其安全性问题尚存在争议。研究表明，含较高浓度藏花素的栀子黄色素(含量92%)对大鼠的急性经口LD50为3.16～4.64 g/kg[5]；含较低浓度藏花素的栀子黄色素(含量44.82%)对大鼠的急性经口LD50>15 g/kg[6]。90天亚慢性毒性实验表明，3 000 ppm的栀子黄色素粉剂使大鼠肝细胞内出现脂滴增大增多的趋势[5]；可引起肾小管上皮色素沉着，主要作用靶器官为肝脏和肾脏，其NOAEL为0.5 g/kg[7-8]；1.5 g/kg及以上剂量染毒动物出现体重减轻、胃肠道功能障碍、肝肾毒性等炎症反应和局部损伤[6]。
有关栀子黄色素的发育毒性的研究尚未见报道。本研究参考欧洲替代方法验证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的胚胎干细胞试验(DB-ALM Protocol n°113)、大鼠植入后全胚胎培养试验(DB-ALM Protocol n°123)和微团培养试验(DB-ALM Protocol n°122)三种发育毒性的体外替代模型[9]，评价食用色素栀子黄潜在的体外胚胎发育毒性，以补充栀子黄色素的毒理学资料。
材料与方法
一、受试物
受试物栀子黄E500，藏花素含量46.11%。购自河南中大恒源生物科技股份有限公司。
二、实验动物与细胞株
SPF级SD大鼠(雄性280～300 g，雌性220～240 g)，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于屏障环境，室温20～25℃，湿度50%～60%，12 h明暗周期，自由饮水和摄食。适应性饲养5 d后将雌、雄SD大鼠于18:00按2:1比例合笼，次日7:00进行阴道涂片检查，镜下可见精子视为受孕，并记为受孕0 d。取受孕9.5 d的胚胎进行全胚胎培养，取受孕13 d的胚胎进行微团培养。实验方案由北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准。
小鼠胚胎干细胞系ES-D3[D3](ATCC®CRL-11632TM)、小鼠胚胎成纤维细胞BALB/3T3克隆A31细胞系(ATCC®CCL-163TM)及小鼠胚胎成纤维细胞系STO(ATCC®CRL-1503TM)均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。
三、胚胎干细胞试验模型
1.细胞培养：STO细胞及BALB/3T3细胞在高糖DMEM完全培养基中传代培养。ES-D3细胞日常培养于Knockout DMEM完全培养基，需以STO细胞为饲养层进行培养，以获取其维持未分化状态所需的细胞因子。以上细胞均培养于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱。
2. ES-D3及BALB/3T3细胞毒性测试：取与STO饲养层分离后的ES-D3细胞悬液或BALB/3T3细胞悬液，以每孔500个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，染毒7 d后以MTT法进行细胞毒性测试。栀子黄终浓度为0、7.8、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL。每个浓度设置6个复孔，试验平行重复3次。
3. ES-D3细胞分化测试：取与STO饲养层分离后的ES-D3细胞悬液，以每滴500个细胞、30 μl/滴的量点种于100 mm直径培养皿盖中，每盖接种50-60滴，将皿盖轻轻翻转倒扣于培养皿上进行悬滴培养。3 d后用染毒液将皿盖上的拟胚体(embryoid bodies, EBs)转移至60 mm直径细菌培养皿中进行悬浮培养。2 d后将染毒液以1 ml/孔的量加入24孔细胞培养板中，将EBs转移至孔板中央进行贴壁培养。5 d后于相差显微镜下观察，有心肌搏动者可认为胚胎干细胞分化为心肌细胞。对照组心肌搏动率记为100%(对照组初始心肌搏动率须大于87.5%)。
参照ECVAM关于胚胎干细胞培养模型的指南，以阳性物5-FU建立胚胎干细胞培养模型。依据细胞毒性测试的结果将栀子黄终浓度设定为0、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0 μg/mL。
4.发育毒性预测：根据560nm处吸光度值计算栀子黄抑制50%的ES-D3及BALB/3T3细胞增殖时的浓度IC50-D3及IC50-3T3。根据各组心肌搏动率计算栀子黄抑制50%的ES-D3细胞分化的浓度ID50。胚胎干细胞试验模型的发育毒性预测模型包括三个判别方程(表1)。若方程I的值高于方程II和方程III，化学物判定为无发育毒性化学物；若方程II的值高于方程I和方程III，化学物判定为弱发育毒性化学物；若方程III的值高于方程I和方程II，化学物判定为强发育毒性化学物。
表1 胚胎干细胞试验模型的发育毒性预测模型
Table 1 Prediction model of developmental toxicity in embryonic stem cell test
FunctionsPrediction modelFunction I 5.916×lg(IC50-3T3)+3.500×lg(IC50-D3)-5.307×[(IC50-3T3-ID50)/IC50-3T3]-15.27Function II 3.651×lg(IC50-3T3)+2.394×lg(IC50-D3)-2.033×[(IC50-3T3- ID50)/IC50-3T3]-6.85Function III-0.125×lg(IC50-3T3)-1.917×lg(IC50-D3)+1.500×[(IC50-3T3- ID50)/IC50-3T3]-2.67
Note:The unit of each endpoint is μg/mL.
四、全胚胎培养试验
受孕9.5 d SD大鼠，乙醚麻醉后处死，无菌环境中于体视显微镜下分离胚胎。挑选含3～5个初始体节、外形饱满的健康胚胎，随机分组，每组至少7只，于37℃预温、含相应浓度受试物的即刻离心血清(100%大鼠血清、56℃灭活30 min、0.22 μm过滤、-20℃保存)中进行旋转培养。48 h后根据Brown′s评分法(表2)对胚胎进行功能及形态学评分。
表2 Brown′s全胚胎培养形态学评分标准
Table 2 Brown′s morphological scoring criteria in whole embryo culture test
Tissue/SystemScore01234Yolk sac blood vesselsNo visible or scattered blood islandsCorona of blood islands w or w/o anastamosesVitelline vessels with few yolk sac vesselsFull yolk sac plexus of vesselsYolk stalk obliterated:vitelline artery & vein well separatedAllantoisAllantois free in exo-coelomeAllantois fused with chorionUmbilical vesselsSeparate aortic origins of umbilical and vitel-line vesselsFlexionVentrally convexTurningDorsally convexDorsally convex with spiral tosionHeartNot beatingBeating ‘S’ shaped cardiac tubeConvoluted cardiac tubeBulbus cordis, atrium commune and ventricu-lus communisDividing atrium com-muneCaudal neural tubeNeural plate or neural foldsClosing bute unfused neural foldsNeural folds fusedPosterior neuropore formed but openPosterior neuropore closedHind brainNeural plateRhombomeres A and BAnterior neuropore formed but openAnterior neuropore closed, rhombencephalon formedPronounced pontine flex-ure with transparent root of 4th ventricleMid brainNeural plateMesencephalic brain foldsClosing or fusing mes-encephalic brain foldsCompletely fused mes-encephalonVisible division between mesencephalon and di-encephalonFore brainNeural plateProsencephalic brain foldsCompletely fused Pros-encephalonVisible telencephalic evaginationsWell elevated telence-phalic hemispheresOtic systemNo sign of otic devel-opmentFlattened or indented otic primordiumOtic pitOtocystOtocyst with dorsal re-cessOptic systemNo sign of optic devel-opmentSulcus opticusElongated optic primor-diumPrimary optic vesicle with open optic stalkIndented lens plateOlfactory sys-temNo sign of olfactory de-velopmentOlfactory plateOlfactory plate with rimDistinct olfactory ridgesLateral nasal process and medial rimBranchial barsNone visibleⅠ visibleⅠ and Ⅱ visibleⅠ, Ⅱ and Ⅲ visibleⅡ overgrowing and ob-scuring ⅢMaxillary processNo sign of maxillary developmentMaxillary process de-marcatedMaxillary process fused with nasal processMandibular processNo sign of mandibular developmentFirst branchial bars fused and forming mandibular processFore limbNo sign of fore limb developmentDistinct evagination of wolfran crest at level of somites 9-13Fore limb budPaddle shaped fore limb budDistinct apical ridge on fore limb budHind limbNo sign of hind limb developmentDistinct evagination of wolfran crest at level of somites 26-30Hore limb budPaddle shaped hore limb budSomites0 - 67 - 1314 - 2021 - 2728 - 34
根据ECVAM全胚胎培养模型的建议，若1 000 μg/mL受试物无明显致畸效应，全胚胎培养模型可认定其为无发育毒性物质。本研究中栀子黄色素浓度为0和1 000 μg/mL。
五、微团培养模型
1.微团培养：受孕13 d SD大鼠，乙醚麻醉后处死，取出子宫将胚胎从蜕膜团中分离，挑选含40～45个体节的健康胚胎，取其肢芽制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×107 个/mL，于96孔细胞培养板每孔正中央点种5 μL，待细胞贴壁后每孔补足200 μL含相应浓度受试物的Ham′s F-12培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养5 d。
参照ECVAM关于微团培养模型的指南，以阳性物5-FU建立微团培养模型；栀子黄的终浓度为0.0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1000.0 μg/mL。每个浓度设置6个复孔，试验平行重复3次。
2. 微团细胞增殖及分化检测：经中性红染色后，活细胞将主动摄取中性红染料，并在酸性条件下呈粉色，其显色程度与活细胞数呈正比。染毒结束后，以0.005%中性红染色3 h后固定细胞30 min，以酸性乙醇提取60 min后于540 nm测定吸光度值以检测其细胞增殖能力。经阿利新蓝染色后，软骨细胞内的酸性蛋白多糖将呈现蓝色，其显色程度与软骨细胞数目呈正比。以 1%阿利新蓝室温染色过夜，6 mol/L盐酸胍提取2 h后于620 nm测定吸光度值以检测其细胞分化能力。
3. 发育毒性预测：根据中性红染色测定的吸光度值，计算50%细胞增殖活性被抑制时的浓度(IC50)；根据阿利新蓝染色的吸光度值计算50%细胞分化及集落形成受抑制的浓度(ID50)。微团培养模型的发育毒性预测模型包括三个判别方程(表3)。若方程I的值高于方程II和方程III，化学物判定为无发育毒性化学物；若方程II的值高于方程I和方程III，化学物判定为弱发育毒性化学物；若方程III的值高于方程I和方程II，化学物判定为强发育毒性化学物。
表3 微团培养模型的发育毒性预测模型
Table 3 Prediction model of developmental
toxicity in micromass test
FunctionsPrediction modelFunction I 6.65×log(ID50)-9.49Function II 6.16×log(ID50)-8.29Function III-1.31×log(ID50)-1.42
Note:The unit of endpoint is μg/mL.
六、统计学分析
采用SPSS 26.0数据统计处理分析软件对数据进行分析。当数据满足正态分布和方差齐性时，采用单因素方差分析(one way ANOVA)并进行Dunnett-t法两两比较。当不满足正态分布或方差不齐时，采用Mann-Whitney U检验。采用Linear-by-Linear Association法进行剂量相关趋势性检验。设定统计学检验水准α=0.05，P<0.05时差异有统计学意义。各培养模型中的IC50及ID50使用GraphPad Prism 7 对数模型进行拟合计算。
结 果
一、胚胎干细胞试验评价栀子黄色素的体外发育毒性
1.胚胎干细胞试验模型验证：将5-FU对ES-D3及BALB/3T3细胞毒性、对ES-D3细胞分化的结果，经GraphPad Prism 7软件拟合计算，其IC50-3T3为122.7 ng/mL，IC50-D3为84.3 ng/mL，ID50为26.6 ng/mL。代入胚胎干细胞试验模型的发育毒性预测判别公式得出：Function Ⅰ=-28.56，Function Ⅱ=-14.33，Function Ⅲ= 0.67，Function Ⅲ的值>Function Ⅰ和Function Ⅱ，评价5-FU为强发育毒性物质，符合该预测模型的建立标准，证明该模型建立成功。
2.胚胎干细胞试验模型评价栀子黄色素的发育毒性：如图1D和1E所示，250 μg/mL以上浓度栀子黄可对BALB/3T3细胞增殖产生明显影响，其IC50-3T3为236.57 μg/mL；62.5 μg/mL以上浓度的栀子黄可抑制ES-D3细胞的增殖，其IC50-D3为231.87 μg/mL。
如图1F所示，62.5 μg/mL的栀子黄可明显抑制ES-D3细胞向心肌细胞分化，经GraphPad Prism 7软件进行对数曲线拟合，计算出栀子黄对ES-D3细胞分化的ID50为94.84 μg/mL，将拟合所得IC50-3T3、IC50-D3及ID50代入胚胎干细胞试验预测模型的发育毒性预测判别公式得出：Function Ⅰ=3.87，Function Ⅱ=6.26，Function Ⅲ=-6.60，Function Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，评价栀子黄为弱发育毒性物质。
图1 5-FU和栀子黄色素对BALB/3T3和ES-D3细胞的影响
Figure 1 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment on BALB/3T3 and ES-D3
(A)、(B)和(C)：5-FU对BALB/3T3和ES-D3细胞增殖的影响以及对ES-D3细胞分化的影响；(D)、(E)和(F)：栀子黄色素对BALB/3T3和ES-D3细胞增殖的影响以及对ES-D3细胞分化的影响。*P<0.05，**P<0.01。
(A), (B) and (C):Effects of 5-FU on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively; (D), (E) and (F):Effects ofgardenia yellow pigment on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively. *P<0.05, **P<0.01。
二、全胚胎培养试验评价栀子黄色素的发育毒性
根据ECVAM的建议，在全胚胎培养试验中若1000 μg/mL受试物无明显致畸效应，全胚胎培养模型可认定其为无发育毒性物质。本研究中此剂量下栀子黄对胚胎卵黄囊直径、顶臀长、头长、体节数及形态学评分均无明显影响，故可认为栀子黄为无发育毒性物质。
表4 栀子黄对胚胎各系统发育的影响
Table 4 Effect of gardenia yellow pigment on 
Concentration (μg/mL)Gardenia yellow0(n=9)1 000(n=10)Yolk sac diameter (mm)4.61±0.274.48±0.38Crown-rump length (mm)3.94±0.173.65±0.45Head length (mm)2.14±0.101.95±0.35Somites number26.22±0.6726.27±1.10TMS50.89±0.3350.91±0.54Yolk sac blood vessels4.00±0.004.00±0.00Allantois3.00±0.003.00±0.00Flexion3.00±0.003.00±0.00Heart3.00±0.003.00±0.00Caudal neural tube4.00±0.004.00±0.00Hind brain4.00±0.004.00±0.00Mid brain4.00±0.004.00±0.00Fore brain4.00±0.004.00±0.00Otic system4.00±0.004.00±0.00Optic system4.00±0.004.00±0.00Olfactory system4.00±0.004.00±0.00Branchial bars2.00±0.002.00±0.00Maxillary process1.00±0.001.00±0.00Mandibular process1.00±0.001.00±0.00Fore limb2.00±0.002.00±0.00Hind limb0.89±0.330.82±0.40Somites3.00±0.003.09±0.30
TMS:Total morphological score.
三、微团培养试验评价栀子黄色素的发育毒性
1.大鼠微团培养模型的建立与验证：将5-FU对微团细胞增殖及分化影响的结果，经GraphPad Prism 7软件进行对数曲线拟合计算，其IC50为109.10 ng/mL，ID50为90.85 ng/mL，代入微团培养模型的发育毒性预测判别公式得出：Function Ⅰ=-16.01，Function Ⅱ=-14.33，Function Ⅲ=-0.14，Function Ⅲ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅱ，评价5-FU为强发育毒性物质，符合该预测模型的建立标准，证明该模型建立成功。
2.微团培养模型评价栀子黄色素的发育毒性：如图2B所示，100 μg/mL及以上浓度的栀子黄可显著降低大鼠肢芽细胞增殖能力及分化为软骨细胞的能力，其IC50为175 μg/mL。随栀子黄浓度升高，微团形成数目逐渐减少，软骨细胞阿利新蓝着色程度逐渐降低，单个微团体积逐渐减小，细胞迁移距离逐渐缩短，至400 ng/mL组已无微团形成(图3)。
图2 5-FU和栀子黄色素对肢芽细胞
增殖活性和分化的影响
Figure 2 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment on
cell proliferation and differentiation of limb bud cells
**：P<0.01；#：P<0.05，##：P<0.01。
**:P<0.01; #:P<0.05, ##:P<0.01.
图3 栀子黄对肢芽微团形成的影响
Figure 3 Effect of gardenia yellow pigment on limb bud micromass formation
经GraphPad Prism 7软件进行对数曲线拟合计算，其ID50为152 μg/mL，代入微团培养模型的发育毒性预测判别公式得出：Function Ⅰ= 5.02，Function Ⅱ=5.15，Function Ⅲ=-4.28，Function Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，评价栀子黄为弱发育毒性物质。
讨 论
栀子黄色素具有较好的着色性能，且研究表明具有抗疲劳、抗氧化、抗炎及降血糖作用等[10-13]。在我国和日本等周边国家，栀子黄色素已作为食品添加剂广泛使用。但栀子黄色素的食用安全性问题尚存在争议。缺乏对其发育毒性的研究。本研究旨在通过体外发育毒性预测模型评价栀子黄色素的胚胎发育毒性，补充其毒理学资料，为确定栀子黄接触的健康指导值、开展风险评估奠定基础。
全胚胎培养、微团培养和胚胎干细胞试验模型为ECVAM验证的发育毒性体外替代方法，具有耗时短、花费少，灵敏度高等特点，更符合动物实验的福利伦理及“3R”原则，即减少(Reduction)、优化(Refinement)、替代(Replacement)，可用于潜在胚胎发育毒性的筛选试验。胚胎干细胞试验依据受试物对干细胞分化过程的影响判断受试物在胚胎植入前阶段的潜在发育毒性；全胚胎培养可以完整的模拟生物体植入后胚胎器官形成早期(孕9.5至11.5 d)对受试物的暴露过程；微团培养从肢芽细胞向软骨细胞分化能力的角度，判断受试物是否具有中晚期(孕13天至18 d)发育毒性[14]。根据胚胎干细胞预测模型判断栀子黄为弱发育毒性物质。但ECVAM的指南中提示，若IC50和ID50的比值大于2，说明该物质具有特异的潜在致畸性；若比值小于2，说明该物质的发育毒性可能是由于细胞毒性引起的。在胚胎干细胞试验模型中，栀子黄对ES-D3细胞的IC50为231.87 μg/mL，远高于ID50(94.84 μg/mL)，提示栀子黄色素可能具有潜在的特异性胚胎发育毒性，且栀子黄对植入前胚胎干细胞的毒性效应更值得关注。
本研究发现，1 000 μg/mL栀子黄色素对大鼠植入后胚胎生长和发育无明显影响，依据ECVAM指南建议，可判定其在胚胎器官形成期无发育毒性。
栀子黄色素可抑制肢芽细胞增殖活性，降低其分化为软骨细胞的能力，对肢芽细胞的生长、迁移及再聚合具有一定影响。本研究发现，100 μg/mL栀子黄色素即可降低肢芽细胞的增殖能力及分化能力，对微团形成数目及形态产生影响，依据ECVAM微团培养预测模型判定其为弱发育毒性物质。但其IC50和ID50值极为接近，表明栀子黄色素在大鼠胚胎发育中晚期的肢芽细胞分化阻滞效应可能是由细胞毒性引起的。
栀子黄色素的主要活性成分为藏花素及藏花酸，但同时也含有绿原酸、多酚类物质黄酮及环烯醚萜苷类物质栀子苷等成分，此为导致栀子黄色素发生绿变的主要原因[15-16]。本研究中所用栀子黄色素为混合物，含藏花素46.11%、栀子苷0.03%。因此，栀子黄色素引起胚胎发育毒性的具体原因尚需进一步实验确定。
综上，可初步认为栀子黄属弱发育毒性物质。但由于本研究采取的三种替代方法均为体外试验，不能分析母体代谢、母体-胎儿间相互作用等影响，且ECVAM对发育毒性体外替代方法的验证也认为替代方法在强发育毒性化学物的判断上准确性较好，但不能准确判别弱发育毒性化学物和无发育毒性化学物。因此，栀子黄色素的发育毒性还需要更多的实验进一步确认。
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