植入前胚胎异常分裂对胚胎持续发育能力的影响

胚胎持续发育能力是评估体外受精周期胚胎质量和影响临床妊娠结局的重要指标。近年来,越来越多的生殖中心通过采用单囊胚移植的临床策略,减少医源性多胎,这也给胚胎实验室精准评估胚胎持续发育能力,提出了新的要求[1]。影响胚胎持续发育能力的因素很多,目前国内外普遍采用传统的形态学评分预估胚胎发育潜能,规定的时间范围内在倒置显微镜下观察原核数目和形态、卵裂球数目、碎片程度及卵裂球大小的均一性等形态学参数[2]。在这些传统评估方式下,所观察到的孤立时间点的参数与评分,带有一定的主观性。近年来兴起的时差成像培养方式,可以连续观察胚胎发育过程,获得更为详细的胚胎发育的时间参数和卵裂方式[3]。其中早期卵裂方式,作为新型的评估指标,其预测胚胎发育潜能的临床意义,越来越引起胚胎学家的重视[4]。本文在时差成像培养条件下,通过观察植入前胚胎的卵裂方式,分析异常卵裂是否出现以及出现的时期,评价其对胚胎持续发育能力的影响,以期更加精准地预测囊胚的形成以及囊胚质量。

对象与方法

1.研究对象:本研究收集2022年5月—10月在南京鼓楼医院生殖医学科进入体外受精周期的患者,在时差成像培养系统中,观察植入前胚胎的卵裂方式,对分裂期胚胎出现异常分裂的23个周期进行回顾性分析。患者纳入标准:(1)常规IVF/ICSI周期,(2)女方年龄≤40 岁,(3)月经第3天卵泡刺激素(FSH)≤12 U/mL,(4)常规长方案促排卵。患者排除标准:(1)完全或部分受精失败,(2)卵子异常,(3)PGT周期。共获得113枚双原核(2PN)后卵裂的胚胎。按照分裂期胚胎早期卵裂方式分为:正常卵裂组(n=72),在第1次、第2次卵裂周期中分裂方式均为正常;异常卵裂组(n=41),在第1次、第2次卵裂周期出现异常分裂方式。根据异常卵裂出现的时期,异常卵裂组进一步分层:第1次卵裂异常组(n=20),第1次卵裂周期出现异常分裂;第2次卵裂异常组(n=21),第1次卵裂周期分裂方式正常,第2次卵裂周期出现异常分裂。

2.研究方法:在早期胚胎评估中,反映胚胎持续发育能力的核心指标是能否形成囊胚和形成囊胚的质量,以及胚胎的发育速度是否正常,所以本研究在时差成像中重点观察了形成囊胚的质量并进行评级,记录胚胎发育速度有关的时间参数。

(1)Time-lapse系统。采用EmbryoScope+(Vitrolife,瑞典)时差培养箱,培养箱内置高分辨率照相机(3像素/微米),拍照频率10分钟/次。

(2)配子采集与胚胎培养。采用常规促排卵方案[5],B超监测卵泡生长,待主导卵泡直径达到18～20 mm后注射hCG,36 h后行阴道B超引导下卵泡穿刺取卵术。将获得的卵子按IVF或ICSI方案进行授精后,将受精卵转移至含有G1-PLUS(Vitrolife,瑞典)培养液的时差成像培养皿(Embryoslide+)中,置于Time-lapse系统中培养至第3天,更换到含有G2-PLUS(Vitrolife,瑞典)培养液的时差成像培养皿(Embryoslide+)中,继续培养至囊胚期。

(3)囊胚分级。对形成囊胚者根据ALPHA/ESHRE指南对其质量进行分级,根据囊胚的扩张和孵出程度将其分为Ⅰ～Ⅵ级,根据内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层(trophectoderm,TE)的质量分为A～C级[6]。

(4)胚胎评估。授精后67～69 h,88～90 h,106～108 h,138～140 h进行胚胎形态学参数观察,本研究中囊胚评级为AA、AB、BA、BB的定义为优良囊胚。记录囊胚化开始时间tSB(time from insemination to start of blastulation),囊胚形成时间tB(time from insemination to formation of full blastocyst)以及扩张囊胚形成时间tEB(time from insemination to expanding blastocyst)。

(5)主要观察指标及定义。“异常卵裂”是针对早期胚胎正常卵裂遵循的有丝分裂过程而言,正常生理情况下,受精卵在第1次有丝分裂后由1个细胞均等地分成2个细胞,在第2次有丝分裂后,由2个细胞均等地分成4个细胞,其他卵裂情况均视为胚胎的早期异常卵裂[7]。本文根据异常卵裂出现的时机,进一步分为第1次卵裂周期出现异常分裂(如1个细胞分裂成3个细胞)和第1次卵裂周期分裂方式正常、第2次卵裂周期出现异常分裂(如1个细胞分裂成2个细胞,再分裂成5个细胞)。在时差成像培养条件下,观察植入前胚胎的发育过程,记录胚胎8细胞形成数、桑葚胚形成数、囊胚形成数以及囊胚质量,记录时差成像中胚胎发育的各项时间参数,重点分析tSB、tB和tEB这些反映囊胚发育速度的时间参数。

3.统计学方法:应用 SPSS 26.0 软件进行数据统计分析。计量资料应用T检验,以均数±标准差表示。计数资料应用χ2 检验,以率(%)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1.符合纳入标准的患者共有23位,总获卵数为113枚2PN,患者年龄范围24～40岁,平均(31.1±4.1)岁。患者的体质指数(BMI)范围18.1～27.5 kg/m2,平均(23.2±3.3)kg/m2。平均抗缪勒管激素水平(3.8±2.2)ng/mL,平均基础卵泡刺激素值(3.8±2.2)U/L,平均获卵数为(12.6±5.0)枚。

2.分裂期胚胎正常或异常卵裂方式:23个周期共获得113枚2PN后卵裂的胚胎,其中72枚分裂期胚胎卵裂方式正常(如图1),41枚出现异常卵裂。根据异常卵裂出现的时期,20枚分裂期胚胎在第1次卵裂周期出现异常分裂(如图2),21枚分裂期胚胎在第1次卵裂周期分裂方式正常、第2次卵裂周期出现异常分裂(如图3)。

3.时差成像系统观察分裂期胚胎卵裂方式对后续胚胎发育的影响:分裂期胚胎在第1次或第2次卵裂周期,出现异常分裂后,与正常卵裂的胚胎相比,在同样时间内观察,8细胞、桑葚胚、囊胚的形成比例均有显著减少(P<0.01)。囊胚形成时间,虽然没有统计学差异,但异常卵裂组在平均tSB、tB以及tEB时间上,呈现延长的趋势。第5天扩张期囊胚的形成比例,异常卵裂组明显少于正常卵裂组(P<0.01)。同时,形成囊胚的整体评分偏差,优良囊胚比例显著减少(P<0.01)。见表1。

四、时差成像系统分析异常分裂出现时期对后续胚胎发育的影响

异常卵裂组中,第1次卵裂异常组,相比第2次卵裂异常组,观察8细胞、桑葚胚、囊胚的形成比例,均呈现减少的趋势。在囊胚形成时间上,第1次卵裂异常组相比第2次卵裂异常组在平均tEB时间上明显延长(P<0.05),平均tSB、tB时间也呈现出延长的趋势。第5天扩张期囊胚的形成比例,第1次卵裂异常组明显少于第2次卵裂异常组(P<0.05),两组均以低质量囊胚为主。见表2。

讨论

准确评估植入前胚胎质量,是辅助生殖实验室重要而核心的工作。常规的形态学评估是传统而经典的胚胎发育评估的方法,但受限于体外观察次数,这种静态评估获得的胚胎发育相关参数较为有限,同时不可避免带有技术人员的主观判断,因此,胚胎学家一直致力于寻找新型的客观的胚胎评估指标,以期更加全面精准的评估胚胎持续发育能力[8]。

植入前胚胎在时差培养的条件下,可以清晰的观测到既往静态培养模式下无法捕捉到的卵裂方式[9]。Kola等[10]与Chatzimeletiou等[11]的研究指出胚胎卵裂过程中一个细胞分裂成三个或以上细胞时,与卵裂过程中染色体的异常分布有关,会对胚胎的后续发育产生不好的影响。Somfai等[4]借助时差成像,发现早期胚胎出现异常卵裂方式会严重影响胚胎的持续发育能力,降低囊胚形成率,早期胚胎出现1个细胞卵裂为3个细胞时,胚胎染色体异常几率会大大增加,如果利用了这种胚胎,会导致较低的临床妊娠率并且增加流产率。异常卵裂相比正常卵裂的胚胎,持续发育能力明显降低,囊胚形成时间延长,囊胚的形成率和囊胚质量下降。

时差成像的动态观察,除了观察卵裂方式以外,还可以精准判断异常分裂出现的时期。Rubio等[12]发现受精卵第1次卵裂周期就出现卵裂方式异常,胚胎染色体的非整倍体比例会明显升高,显著降低种植率。Avidor-Reiss等[13]报道了受精卵第1次卵裂周期中卵裂方式异常一般与精子来源的中心粒异常有关,影响胚胎的后续发育过程。本研究着重观察了不同分裂周期出现的异常分裂,对于胚胎发育的影响。异常分裂出现的周期越早,对后续胚胎发育的影响越大,囊胚形成时间延长,扩张期囊胚形成率明显降低。

时差成像培养系统清晰获取的胚胎卵裂方式,可以作为胚胎评估的客观参数,用于预测胚胎的持续发育能力。文献以及课题组前期研究发现,植入前胚胎早期分裂方式异常,影响囊胚的形成率和囊胚质量;异常卵裂出现越早,对后续胚胎发育的影响越大。胚胎选择的临床策略,宜优先挑选卵裂方式正常的胚胎使用,在无正常卵裂方式的胚胎可利用的情况下,可酌情使用第1次卵裂正常、第2次卵裂异常的胚胎,以期获得较好的种植结局。

1 李丝雨,师娟子.单囊胚移植在人类辅助生殖技术的应用优势及存在问题.医学信息,2021,34:61-64.

2 王芳,李红义,胡春秀.胚胎发育潜能的评估方法及应用价值.医学综述,2022,28:584-590.

3 Kovacs P.Embryo selection:the role of time-lapse monitoring.Reprod Biol Endocrinol,2014,12:124.

4 Somfai T,Inaba Y,Aikawa Y,et al.Relationship between the length of cell cycles,cleavage pattern and developmental competence in bovine embryos generated by in vitro fertilization or parthenogenesis.J Reprod Dev,2010,56:200-207.

5 Zhou J,Wang S,Wang B,et al.The value of HCG serum concentrations after trigger in predicting pregnancy and live birth rates in IVF-ICSI.Reprod Biomed Online,2015,30:667-673.

6 Alpha Scientists inReproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment:proceedings of an expert meeting.Hum Reprod, 2011,26:1270-1283.

7 王江,熊顺,韩伟,等.早期异常卵裂不影响囊胚染色体整倍性.生殖医学杂志,2021,30:1146-1151.

8 胥博,邵帅,谢文燕,等.探究影响囊胚形成的因素及其应用价值.江西医药,2021,56:1723-1728.

9 田可可,王娟,闫虹,等.时差成像技术辅助胚胎选择在单胚胎移植中的应用价值.河南医学研究,2022,31:2905-2909.

10 Kola I,Trounson A,Dawson G,et al.Tripronuclear human oocytes:altered cleavage patterns and subsequent karyotypic analysis of embryos.Biol Reprod,1987,37:395-401.

11 Chatzimeletiou K,Morrison EE,Prapas N,et al.Spindle abnormalities in normally developing and arrested human preimplantation embryos in vitro identified by confocal laser scanning microscopy.Hum Reprod,2005,20:672-682.

12 Rubio I,Kuhlmann R,Agerholm I,et al.Limited implantation success of direct-cleaved human zygotes:a time-lapse study.Fertil Steril,2012,98:1458-1463.

13 Avidor-Reiss T,Mazur M,Fishman EL,et al.The Role of Sperm Centrioles in Human Reproduction - The Known and the Unknown.Front Cell Dev Biol,2019,7:188.