近年来男性不育发病率则逐年上升 [1]。治疗男性不育,提高精子质量,已经成为目前生殖研究的重中之重[2-3]。随着体外受精技术的日渐成熟,已有不少研究通过体外精子优选和化学试剂体外刺激精子,从而有效提高精子的活力和受精能力,最终提高人工授精和体外受精-胚胎移植的妊娠率[4]。
己酮可可碱(pentoxifylline,PF)属于甲基黄嘌呤类化合物,可以改善少弱精子的活力[5]。通过短时间用PF处理精子,可以有效提高精子活动率和精子运动能力[6]。但随着PF处理精子时间的延长,精子膜的完整性明显降低,增加了精子的死亡率[7]。同时过高的PF浓度也会造成精子功能减退及与透明带结合能力的丧失。因此,出于安全性考虑PF在体外提高精子活动率和精子运动能力的特性,只能在低浓度、短时间下应用[8-9]。
本文旨在探讨不同浓度PF较短作用时间下对精子冷冻前后活力和复苏率的影响及其在对精子具体运动功能参数的影响,确定PF的作用浓度和作用时间,寻找出一种采用PF提高精子复苏率和精子活力的方法,以期为人工授精和体外受精技术的研究和实践提供依据,同时也为精子的体外处理技术的发展提供参考。
对象与方法
1.研究对象:选择2019年 4月—12月,在本院精子库健康体检者的精液标本作为研究对象,所有研究对象均依据第五版世界卫生组织(WHO)精子的诊断标准,经医院伦理委员会批准。纳入标准:(1)年龄≥20岁且≤45岁;(2)血常规、肝肾功能正常;(3)获得知情同意,签署知情同意书。排除标准:(1)合并心肺、肝肾功能严重异常者;(2)精神疾病者;(3)传染病患者;(4)有遗传病家庭史或遗传病的。最终纳入了30例健康体检者,年龄21～30岁,平均(24.12±3.82)岁;职业:大学在校生11例,公司白领7例,公务员7例,其他5例;
2.标本处理和观察指标:
(1)冷冻前:所有研究对象均禁欲 3～7 d后试验。采用手淫法取得全份新鲜精液标本,将其放置于 37℃条件下,恒温孵育箱中 30 min 左右,完全液化后备检。将精液分装到5组冷冻管中,每管0.2 mL,其中的4组分别加入配有PF的保护液,使其终浓度分别为0.6 mmol/L、1.2 mmol/L、2.4 mmol/L、3.6 mmol/L,充分混合,对照组加入等体积的保护液。在孵育10 min后,用计算机辅助精子分析仪(computer-aided sperm analysis,CASA)检测精子各项参数,每份标本,观察精子数≥200个,观测3个视野,测定精子浓度和活力不同浓度PF作用下的精子活力[前向运动型(progressive,PR)、 非前向运动型(non-progressive,NP)、完全不动型(immotile,IM)]变化。并进行活力检测及精子运动功能检测[包括精子直线速度straight line velocity,VSL)、曲线速度(curvilinear velocity,VCL)、摆动性(wobble,WOB)、侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement,ALH)、直线性(linearity,LIN)]。
(2)冷冻后:使用Grant EF 600 程序降温仪冷冻精子,按照设置好的精子冷冻曲线,进行冷冻,当温度达到-80℃时,转移到液氮中,在-196℃下保存24 h,然后进行复苏操作。将精液标本冷冻管从液氮中取出,迅速置于37℃水浴中。保温复苏10 min后,取出备检。
3. 统计学方法:各组数据以
表示,采用统计学软件SPSS 22.0进行数据处理,多个均数之间比较用方差分析,组间两两比较检验方差齐性,方差齐用LSD法,方差不齐用Tamhane′s T2 法,P<0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1. PF对精子浓度及复苏率的影响:冷冻前和复苏后的各组精子浓度相互之间没有显著性差异(P>0.05),说明精液混匀程度高,结果可信。与对照相比,添加PF的各组精子复苏率均有增加,其中0.6 mmol/L组、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L组的则有明显增加(P<0.05)见表1;但是增加趋势并未出现明显的浓度依赖性。
表1 不同浓度PF体外对精子浓度及复苏率的影响
组别 冷冻前精子浓度 ( ×10 6 ) 复苏后精子浓度 ( ×10 6 ) 精子复苏率 (%) 对照组 63. 8±28. 5 47. 4±18. 4 51. 7±22. 0 0. 6 mmol / L 组 67. 7±17. 5 57. 4±30. 2 66. 2±19. 2 ∗ 1. 2 mmol / L 组 77. 6±26. 1 54. 3±23. 8 56. 7±14. 8 2. 4 mmol / L 组 67. 8±20. 8 49. 8±22. 7 60. 7±15. 9 ∗ 3. 6 mmol / L 组 70. 3±27. 5 54. 6±32. 6 65. 0±20. 9 ∗
注:*与对照组比较P<0.05
2.PF对精子活力的影响:在精子冷冻前,与对照组相比各组精子PR均没有明显增加(P>0.05);1.2 mmol/L组和3.6 mmol/L组精子NP出现显著减少(P<0.05),其余两组减少不显著(P>0.05);各组精子IM均没有明显减少(P>0.05)。其余组之间没有统计学差异,见表2。在精子复苏后,与对照相比各组精子PR均有增加,其中0.6 mmol/L组、2.4 mmol/L组和3.6组精子出现显著增加(P<0.05);各组精子NP出现增加,其中2.4 mmol/L组精子出现显著增加(P<0.05);各组精子IM均明显减少(P<0.05)。但减少幅度并没有浓度依赖性。
表2 不同浓度PF体外对精子的活力的影响,(%)
组 别 冷 冻 前 精 子 活 力 P R N P I M 复 苏 后 精 子 活 力 P R N P I M 对 照 组 6 9 . 1 ± 7 . 5 9 . 0 ± 3 . 1 2 2 . 1 ± 7 . 5 3 5 . 7 ± 1 5 . 3 7 . 2 ± 3 . 6 5 7 . 1 ± 1 7 . 0 0 . 6 m m o l / L 组 7 0 . 1 ± 7 . 6 8 . 4 ± 3 . 0 2 1 . 6 ± 7 . 1 4 6 . 1 ± 1 3 . 2 ∗ 9 . 3 ± 3 . 4 4 5 . 2 ± 1 4 . 0 ∗ 1 . 2 m m o l / L 组 7 3 . 1 ± 7 . 3 7 . 5 ± 2 . 4 ∗ 1 9 . 4 ± 6 . 5 4 1 . 5 ± 1 2 . 1 9 . 5 ± 7 . 1 4 9 . 0 ± 1 4 . 3 ∗ 2 . 4 m m o l / L 组 7 1 . 5 ± 1 . 2 7 . 8 ± 3 . 0 2 0 . 6 ± 1 0 . 3 4 3 . 4 ± 1 2 . 6 ∗ 1 0 . 7 ± 7 . 1 ∗ 4 5 . 9 ± 1 3 . 8 ∗ 3 . 6 m m o l / L 组 7 2 . 6 ± 9 . 5 7 . 3 ± 2 . 8 ∗ 2 0 . 1 ± 9 . 9 4 7 . 1 ± 1 5 . 6 ∗ 7 . 8 ± 3 . 2 4 5 . 5 ± 1 6 . 3 ∗
注:*与对照组比较P<0.05;PR:前向运动型;NP:非前向运动型;IM:完全不动型
3.PF对精子运动功能的影响:各组的精子VSL均没有显著性差异。与对照相比,1.2 mmol/L组、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L 组的精子VCL均有明显增加(P<0.05);1.2 mmol/L组、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L 组的精子ALH均有明显增加(P<0.05);1.2 mmol/L、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L 组的精子WOB均有明显减少(P<0.05);1.2 mmol/L、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L 组的精子LIN均有明显减少(P<0.05);并且1.2 mmol/L、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L 组的VCL、ALH、WOB和LIN的变化幅度均出现了一定的浓度依赖性,见图1。
注:a代表与对照组比较p<0.05;b代表与0.6 mmol/L组比较p<0.05;c代表与1.2 mmol/L组比较p<0.05,mM为Mmol/L的简写。
图1 冷冻前不同浓度PF体外对精子运动功能的影响
与对照相比,4个组的精子VSL均有明显增加(P<0.05);0.6 mmol/L组、2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L组的精子VCL均有明显增加(P<0.05);2.4 mmol/L组和3.6 mmol/L组的精子ALH均有明显增加(P<0.05);1.2 mmol/L组和2.4 mmol/L组组的精子WOB均有明显减少(P<0.05);4个组的精子LIN均没有显著性差异,见图2。
注:a代表与对照组比较P<0.05;b代表与0.6 mmol/L组比较P<0.05;c代表与1.2 mmol/L组组比较P<0.05,mM为Mmol/L的简写。
图2 复苏后不同浓度PF体外对精子运动功能的影响
讨论
精子的运动是需要耗能的,能量一般认为是由精子线粒体提供,而线粒体的供能受糖酵解及一系列磷酸化作用所调节,受到腺苷酸环化酶系统的控制[10]。PF提高精子活力及运动功能的机制尚不十分明确,普遍认为可能与环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)有关。cAMP可以调节磷酸化作用,从而影响精子供能,可以影响精子尾部轴丝的运动,还能调节精子细胞膜上离子流动,尤其是钙离子的转运,这些因素均可最终影响到精子运动[11]。PF是一种为黄嘌呤衍生物,属于非特异性的磷酸二酯酶抑制剂,可以cAMP转为腺苷酸(adenosine monophosphate,AMP),升高精子细胞内cAMP浓度,最终提高精子的运动功能[12]。
相较于健康人群,少弱精子症患者的精子冷冻保存难度更大,因而目前PF的研究和应用大多集中在该类患者的精子冷冻上,但是其冷冻复苏原理与健康人群是相通的,已酮可可碱的作用机制是一致的。本实验选取的是健康体检者检查剩余的精液标本,实验对象的精子本身的活动率都>60%,采用正常精液研究的好处是不需要进行精液离心上游,精子优选等操作,能够更好的排除各种培养液的干扰,从而为临床更好的提供数据支持。
为减少对精子的损伤,本实验主要考虑了:已酮可可碱的浓度、孵育时间和添加顺序这三个因素。通过文献调研发现,体外应用已酮可可碱的常见浓度有:0.1、0.3、0.6、1、1.8、2、3、3.6、4、5、7.2、8、16 mmol/L等;作用时间有:5、10、30、60、120 min等[10,12-13]。经过预实验摸索,最终选取了0.6 mmol/L、1.2 mmol/L、2.4 mmol/L、3.6 mmol/L四个浓度梯度。同时,理论上应尽量缩短己酮可可碱的孵育时间。但在实际操作中,由于精液混匀、检测读数、形成报告等均需要时间,操作时间会不可避免的带来误差。而孵育时间越短,则操作时间的带来误差干扰就越大。综合考虑,本实验选取的孵育时间为10 min。
在冷冻前添加己酮可可碱,不仅使操作更为简便,对精子的损伤也更小,具体表现在:1)在冷冻时,直接使用添加了己酮可可碱的保护剂进行冷冻,这样相对于正常冷冻来说没有增加溶剂。2)由于在冷冻程序降温阶段和复苏孵育阶段,已酮可可碱已经存在于精液中,从而发挥作用了,相对于复苏后再添加,则能节省复苏后孵育的时间。3)冷冻前的精子更易耐受混匀搅拌,从而增加了精子的存活率。
为减小误差,本实验使用程序降温仪进行精子冷冻,可以保证同一实验批次的精子标本,以相同的冷冻曲线进行冷冻。使用计算机辅助精子分析仪(CASA)检测精子各项参数,每份标本观察精子数≥200个,观测3个视野,从而排除人肉眼观察的误差。同时为更准确的判断精子活力变化,本实验将精子运动能力参数化,这些参数是CASA根据精子的运动轨迹,使用特定公式计算得到的,可以更为精确的描述精子的运动功能[14]。其中直线速度VSL和曲线速度VCL是最有代表性的两个精子运动指标,值越高则精子活力越好。摆动性WOB越小则摆动性越大,说明精子活力越高。侧摆幅度ALH的值越高,精子的活力越高。直线性LIN,也称线性度,为精子运动曲线的直线分离度。精子的运动能力直接决定了精子的活力,对这些运动参数进行统计分析,有助于更深入的判断精子的活力变化。
实验结果显示添加PF后,不会对精液的浓度产生影响。在冷冻前后均可以改善精子活力,能够显著的提高精子的复苏率;能够提高精子活力,提高其中PR精子的占比,降低IM精子的占比;能够提高精子的运动能力,尤其是对VSL和VCL的提高最为显著。这种提高作用在精子冷冻前后均有体现,复苏后PF的提高作用更加明显,并且随着PF浓度的增加,复苏率逐渐提高。目前数据显示在体外作用10 min时,终浓度为3.6 mmol/L的PF作用效果最好。
此项研究具有重要的临床意义,如行ICSI时,如果男性患者的精液中没有a级和b级精子,只有c级精子时,可以尝试选择低浓度的PF进行短时处理,如果c级精子得以激活成a级或b级精子,则会有效提高工作人员挑选效率[15]。
需要说明是文中数据针对的只是健康男性精子冷冻前添加PF对其活力和精子运动的影响。所以对于少弱精症患者的精子而言,本实验结果仅具备参考价值,还有待进一步实验。此外,由于满足实验条件的健康体检者数目较少,所以样本量较少,实验结果仍需要验证。
1 朱永通,褚庆军,全松.不动精子症的研究进展.生殖医学杂志,2019,28:564-568.
2 王慧芳,袁亚男,王静,等.以线性模型分析季节对不育男性精液质量的影响.中国药物与临床,2020,20:3742-3743.
3 Lu Y,Su H,Zhang J,Wang Y,Li H.Treatment of Poor Sperm Quality and Erectile Dysfunction With Oral Pentoxifylline:A Systematic Review.Front Pharmacol,2022,12:789-787.
4 单芳,胡蓉,王飞苗,等.精子激活在辅助生殖技术中的应用.生殖医学杂志,2020,29:1668-1671.
5 Rezaie MJ,Allahveisi A,Raoofi A,et al.In vitro effects of pentoxifylline and coenzyme Q10 on the sperm of oligoasthenoteratozoospermia patients.Hum Fertil(Camb),2021:1-10.
6 王慕华.己酮可可碱对人精子功能影响的体外实验研究.山西医科大学,2007.
7 Guasti PN,Monteiro GA,Maziero RR,et al.Pentoxifylline effects on capacitation and fertility of stallion epididymal sperm.Anim Reprod Sci,2017,179:27-34.
8 陈智勤,潘家坪,滕晓明.己酮可可碱处理睾丸不动精子行ICSI的临床作用.诊断学理论与实践,2018,17:92-97.
9 黄政城,汤海瑜.己酮可可碱治疗男性少弱畸形精子症的临床研究.临床医学工程,2019,26:1531-1532.
10 张慧娜,王丽媛,习海涛.不同浓度己酮可可碱对精子功能的影响研究.中国现代医生,2019,57:35-38.
11 李磊,江一平.己酮可可碱对精子运动能力和受精能力的影响.福建医科大学学报,2007,41:191-193.
12 李彤,李汉忠,李宏军,等.己酮可可碱对精子活力的体外改善作用.中国男科学杂志,2005,19:34-35.
13 Mahaldashtian M,Khalili MA,Nottola SA,et al.Does in vitro application of pentoxifylline have beneficial effects in assisted male reproduction?.Andrologia,2021,53:e13722.
14 Dardmeh F,Heidari M,Alipour H.Comparison of commercially available chamber slides for computer-aided analysis of human sperm.Syst Biol Reprod Med,2021,67:168-175.
15 刘锋,高一丰,盖安生.一种稀少精子冷冻保护剂及其应用,CN104365583A[P].2015.