新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是全球范围内新生儿脑病的最常见类型,也是新生儿致残、致死的重要原因。2021年,英国报道HIE发病率2.96‰[1],而发展中国家发病率为26‰[2]。幸存新生儿不良结局风险可高达 50%[3],最常见的是脑瘫、癫痫、感觉障碍、运动障碍等。HIE的高发病率、高死亡率和高致残率给家庭带来了巨大的经济和精神负担,也为全球公共卫生事业带来了挑战,因此,探索新的治疗策略,减少死亡率,改善不良预后成为迫切的临床需求。本文对亚低温治疗、促红细胞生成素、褪黑素及其他处于探索阶段的治疗方案进行综述。
一、亚低温治疗
亚低温治疗(hypothermia treatment,HT)的神经保护作用涉及HIE脑损伤的多个过程,其核心在于抗炎、抗凋亡以及抗氧化应激效应。低温可以使兴奋性氨基酸释放减少、谷氨酸反向转运体表达下调、一氧化氮和自由基产生受抑以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体激活减少;同时低温抑制乙酰辅酶A增加细胞的乙酰化,抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase酶)和小胶质细胞活性,发挥抗兴奋性毒性作用,减少炎症因子表达,增加抗炎细胞因子的合成,从而发挥神经保护作用。
1.临床前证据:早产儿因脑特异性成熟障碍在缺氧缺血损伤(hypoxic-ischemic injury,HI)中表现出更复杂的病理生理过程,有必要对治疗的有效性和安全性进行探讨。Bennet等人在HI模型中进行持续72h的HT,结果显示神经元和未成熟少突胶质细胞损失显著减少、脑白质和脑灰质的损伤减轻,证实了亚低温治疗在早产儿中的生物学合理性[4]。
2.临床证据:早产儿HIE亚低温治疗已经开展了小范围的临床研究。Rao等人的研究发现,早产儿HT治疗后死亡率和不良反应发生率更高,MRI结果显示脑损伤更严重,但研究中患儿脑损伤和多器官损伤程度较重可能导致了研究结局的差异[5]。Hanne等人随后发现晚期早产儿HT治疗后,中度HIE患儿的智力和精神运动发育与年龄相符,证实了早产儿HIE应用HT的有效性[6]。另一项随机对照研究于2022年12月底完成,尚未发布结果[NCT:01793129]。
3.安全性:亚低温治疗安全性良好,治疗期间具有在良性生理效应,如窦性心动过缓、轻度血小板减少症和头皮水肿,但Herrera等人的研究发现早产HIE患儿HT治疗后具有不良结局发生风险,如死亡或中重度神经发育障碍、凝血障碍、低血压、持续肺动脉高压、血小板减少、颅内出血等[7]。因此,早产儿亚低温治疗可能存在不同的安全性特征,需要重新评估。这一问题也许能在国际儿童和人类健康发展中心牵头的研究中得到解答[NCT:01793129]。
二、促红细胞生成素
促红细胞生成素(erythropoietin,Epo)是胎儿肝脏中合成的内源性蛋白质,与刺激红细胞生成、抗炎、抗兴奋性、抗氧化和抗凋亡作用以及促神经发生和血管生成密切相关。Epo受体在中枢神经系统的多种细胞类型中广泛表达。当机体经历HI时,血脑屏障通透性增加,Epo及其受体表达上调,脑脊液中Epo浓度增加,从而减少细胞凋亡、减轻兴奋性毒性损伤,最终导致细胞增殖、生存和分化的改变。
1.临床前证据:早期的动物实验为Epo的神经保护作用提供了一致的有利证据。Epo的神经保护高度依赖于HI后开始治疗的时间,窒息后早期(30分钟)开启Epo治疗能显著减少组织学损伤、改善电生理及促脑血管恢复[8]。但临床中早期开始治疗有时很难做到,Oorshcot等人进一步探索了延迟给药的神经保护作用,HI后48 h给予Epo治疗仍能改善神经发育预后[9]。随后Pang等人在新生仔猪中证实HT联合Epo治疗的神经保护作用,表现为25～30 h时振幅整合脑电图恢复更快,促进少突胶质细胞存活方面最有效,这些获益可能与最终的运动和认知水平改善相关[10]。
2.临床证据: Zhu等人基于有益的理论基础和大量临床前试验开展了第一项临床研究,证实Epo治疗对于中度HIE患儿长期预后的改善作用[11]。Malla等人进一步对比了5剂重组Epo治疗(隔日给药)与生理盐水注射的效果,治疗组死亡率、残疾率及脑瘫发生风险更低,MRI显示的神经系统异常更少[12]。关于联合治疗作用及机制的探索,Wang等人[13]在34名治疗组新生儿应用Epo、维生素C联合HT治疗,对照组接受常规治疗加维生素C,结果发现治疗组氧化应激水平更低,抗氧化酶和抗凋亡因子水平较高,该研究支持低温联合Epo的神经保护作用并初步证实其具体机制,包括抑制细胞凋亡、减少氧自由基和增强抗氧化能力。随后III期早产Epo神经保护试验和大剂量促红细胞生成素治疗窒息和脑病试验均报道,联合HT和Epo治疗不能降低神经发育障碍或2～3岁死亡的风险[14,15]。这些结局的差异提示我们谨慎解读临床前研究以便更好的进行临床转化,HT和Epo的联合治疗方面有待进一步探索。
3.剂量、药代动力学和安全性:目前对于Epo给药的最佳剂量、给药时间和间隔时间尚无一致的结论。临床前研究发现重复给药的效用更显著,且皮下注射3剂5 000 U/kg的Epo显示出最佳神经保护作用[16]。1 000 U/kg静脉注射Epo的最大血药浓度和曲线下面积与临床前试验中报道的神经保护水平最相似,曲线下面积为(131 054±17 083 U * h/L)和最大血药浓度(13 780±2 674 U/L),该剂量下的半衰期为15.0 h[17]。
成人Epo治疗的主要不良反应包活高血压、血栓、红细胞增多症、癫痫、死亡,尚未在新生儿中被报道。但最近HEAL试验提出了质疑,研究指出治疗组婴儿更有可能至少发生一次不良事件,具体原因尚不明确,但这一安全性问题的研究需要引起关注。
三、褪黑素
褪黑素(melatonin,Mel)是松果体分泌的内源性吲哚胺,具有调节昼夜节律、协调能量代谢、保护免受氧化应激和增强免疫的功能。HIE治疗中,褪黑素限制潜伏期损伤,减少与二次能量衰竭相关的神经元死亡,减轻第三阶段的持续脑损伤,具有独特的神经保护作用。通过受体介导的信号转导及非受体途径,Mel直接中和活性氧和活性氮、刺激抗氧化酶活性,间接调节细胞mRNA浓度,发挥抗兴奋性毒性作用。在免疫调节中,Mel减少促炎分子形成,防止磷脂酶A2、脂氧合酶和环氧化酶的炎症衍生激活、减少白细胞的募集。Mel还具有抗凋亡活性,能显著减少促凋亡物质产生,维持线粒体通透性,增强多种细胞拯救途径。
1.临床前证据:新生儿生后的短暂褪黑素缺乏期,为生命早期褪黑素补充治疗提供了理论基础。小鼠HI模型中应用褪黑素治疗后认知表现、学习和记忆、运动功能和协调性明显改善[18]。Aridas JDS等人[19]在新生羔羊模型中每2 h静脉注射5 mg Mel联合HT,发现联合治疗在脑结构、功能和代谢指标上获益大于Mel或HT单独治疗。一篇关于足月、近足月动物模型研究的Meta分析中,作者通过分层亚组分析发现褪黑素作为单一药物或HT的辅助治疗都具有强大的神经保护作用[20]。上述研究支持了Mel的广泛地区适用性,在HT治疗未能广泛开展地区,单独应用也能改善缺氧缺血后的动物模型的神经行为结局。
2.临床证据:褪黑素治疗在临床研究中显示出良好的神经保护作用。Ahmad等人报道经肠道单次给予10 mg褪黑素能提高新生儿28日龄的存活率[21]。Antonio等人进一步探索了联合HT和Mel治疗的作用,发现患儿18月龄时Bayley III测试的认知领域表现更好[22],早产儿生后第一天给予口服Mel治疗显示出Mel对脂质过氧化的保护作用[23],48 h后新生儿氧化应激损伤的标志物水平显著下降。Ahmed进行的meta分析进一步支持褪黑素的神经保护作用[24],并且,作者强调目前研究质量较低,数量有限,未来迫切需要大规模、设计合理、高质量的多中心临床试验明确褪黑素在HIE中的神经保护作用。
3.剂量、药代动力学和安全性:褪黑素的神经保护作用具有剂量依赖性和时间关键性,动物实验的经验说明Mel在生后3 h内应用达到最佳治疗水平,约为15～30 mg/L。但具体转化至HIE治疗的临床实践中仍然需要进一步进行药代动力学研究及药物水平监测,以确保生物利用度并了解个体间差异和HT的影响。
褪黑素在新生儿群体中具有很好的安全性,副作用仅限于其催眠和镇静特性。在新生儿呼吸窘迫综合征的治疗中,褪黑素在24 h内高达70 mg/kg,短期内未显示出严重不良反应。
四、稀有气体疗法
医疗气体目前越来越多的应用于疾病治疗的探索中。氩气、氙气等稀有气体通过拮抗 NMDA 受体、激活转录因子核因子-红细胞衍生2等多种途径发挥强大的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用[25,26]。在进一步的临床前实验中,氙气、氩气在HIE、缺血性卒中、创伤性脑损伤、神经退行性疾病等的多种疾病模型中均被证实其神经保护作用。在HIE治疗领域,稀有气体与HT的联合治疗显示出巨大的转化潜力。
1.氙气:氙气(xenon,Xe)是一种惰性气体,早期在麻醉领域中应用,近年来发现Xe在神经保护方面的巨大潜力。Xe非竞争性抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,降低兴奋性毒性,减少急性细胞损伤,诱导激活抗凋亡因子减少细胞凋亡。并且Xe作为三磷酸腺苷敏感性钾通道活化剂在神经保护方面也发挥了一定的作用。
(1)临床前证据:在大鼠模型中评估了Xe治疗对相关基因表达产生的影响,受损脑组织中炎症基因表达下降,健康脑组织中应激基因表达受到诱导,可能有助于减轻损伤,激活脑组织早期代偿过程[27],随后的研究中发现这种神经保护作用具有浓度依赖性。在联合应用中,Xe与HT联合在体内模型中表现出神经保护作用,并且延迟治疗同样能改善长期功能(8～10周)。
(2)临床证据:一项可行性研究中报道了Xe联合HT抑制癫痫活动的作用,随后18～20个月的随访中,一半研究对象发育正常或仅有轻度精神、心理发育问题[28]。但英国的一项概念验证临床试验显示出与先前研究不一致的结论,该研究纳入了92例中重度HIE患者,随机接受HT或HT联合30%Xe治疗,乳酸盐/N-乙酰天冬氨酸水平和MRI显示的脑损伤在两组之间均缺乏显著差异。这可能提示Xe并不能增强出生窒息后HT的神经保护作用[29],这一结论的差异可能与结局指标的选择及亚低温治疗时间的延迟有关(治疗中位年龄为10 h),且该研究缺乏长期随访。另一项在出生时健康状况不佳的脑损伤婴儿中应用Xe和HT联合治疗的临床试验已经完成,尚未发表最终结果(NCT02071394)。
(3)剂量、安全性:给药剂量或浓度尚无统一标准,部分研究报道在35%～70%浓度范围内Xe应用具有神经保护作用,此后开展的研究多在这一范围内应用。Xe的安全性在早期研究中已经得到认可,麻醉剂量下应用Xe不会导致血流动力学紊乱,无呼吸、肝脏毒性报道,相反Xe具有心脏和肾脏保护作用。
2.氩气:氩气(Argon,Ar)的神经保护作用逐渐被大众所认知。研究显示,Ar增加细胞外调节蛋白激酶1/2磷酸化,激活转录因子核因子-红细胞衍生2,阻断凋亡级联反应,上调Bcl-2的表达;同时,Ar通过激活Toll样受体2和4,减少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性,介导与促炎因子、生长因子和细胞生存因子相关的细胞内信号传导。此外,Ar还可以通过降低白细胞介素-6和高迁移率族蛋白B1水平产生抗炎作用。
(1)临床前证据:氩气的神经保护作用在多种体内外模型中被证实,具体表现为细胞死亡和梗死面积的下降,以及脑水肿的减轻。在创伤性脑损伤的小鼠模型中给予70%氩气/30%O2治疗,早期评估显示小胶质细胞活化降低、脑水肿减轻和神经炎症改善,1月后感觉运动功能恢复加快、认知缺陷显著改善。一项试验模拟了临床上可能遇到的延迟治疗的情景,2h的推迟治疗同样表现出神经学结果的显著改善[30]。联合治疗的有效性在新生仔猪模型中也得到证实,HI后2h开始氩气吸入,浓度45%～50%,联合72h HT,结果显示联合治疗组18h的振幅整合脑电图恢复更快,梗死体积较小[31]。
(2)临床证据:目前没有发表氩气应用于HIE患儿中的研究。
(3)安全性和剂量:氩气的应用对于动物模型的血流动力学、脑氧饱和度和血气分析结果没有影响,没有其他不良反应和毒性反应的报道。目前的临床前试验中应用的氩气浓度多在50～70%范围内,Loetscher等人在50%氩气浓度下观察到了最佳神经保护作用[32]。只有少数研究评估了低浓度或更高浓度氩气的神经保护作用,但目前没有统一具体的应用浓度。
五、高压氧治疗
高压氧治疗(hyperbaric oxygen therapy, HBOT)可以有效改善组织氧合、增加脑血流量,缓解脑组织缺氧、水肿,但其具体的神经保护机制尚未完全阐明。部分研究认为,HBOT抑制IκBα(核因子-κB抑制因子)降解减轻核因子-κB介导的促炎作用,并通过抑制星形胶质细胞、小胶质细胞的激活减轻缺氧诱导的髓鞘损伤,发挥神经保护作用,同时,通过调节相关细胞因子发挥其促血管生成和神经发生作用,最终改善细胞代谢和神经预后。
1.临床前证据:HBOT的神经保护作用在早期的体内外模型中得到了证实。Feng等人在新生小鼠模型中对HBOT的作用展开了初步探索,研究表明,HBOT促进HIE新生大鼠脑室下区神经干细胞的增殖,并具有促进脑损伤后神经系统恢复的治疗潜力[33]。Xue等人通过水迷宫试验发现,HBOT治疗组的HIE小鼠学习记忆能力较对照组明显改善,通过对机制的进一步探索,他们发现发现HBOT治疗组中IL-1β、IL-6、TNF-α和HIF1-α的表达明显受抑,SOD水平显著升高,组织病理学研究同样显示,HBOT了降低HI诱导的小胶质细胞和星形胶质细胞活化,促进少突胶质细胞生成和髓鞘发生[34]。
2.临床证据:目前国内已经开展了HBOT的临床研究。Zhang等人发表了一项系统评价,表明HBOT能降低新生儿HIE的死亡率和神经后遗症的发生率。Gong等人进行的Meta分析再次证实了这一观点,HBOT治疗显著提高总体疗效和致残率,降低新生儿行为神经功能评估评分,进一步的亚组分析发现,每日摄氧时间30～40分钟,压力0.04～0.08 mpa,治疗持续时间超过30天为最佳治疗方案[31]。联合治疗的疗效也在探索中。刘滢等人对比HBOT联合HT治疗和单独HT治疗的疗效,通过振幅整合脑电图、6月龄的发育商和智力指数以及癫痫发病率的评估,发现联合治疗对HIE患儿的预后改善更明显。时改善更明显,癫痫发病率更低,6个月时的发育商和智力指数较好[35]。HBOT与Epo及神经节苷脂等药物联合应用也能达到预期治疗效果。
3.安全性和剂量:长期应用HBOT可能会导致氧中毒,引起全身多器官系统损害,严格控制高压氧治疗的压力和时间能有效避免不良反应的发生。研究表明,压力控制于1.4～1.6 ATA以内,辅以间歇吸氧的方式安全有效。而Gong等人的meta分析则发现0.04～0.08 mpa的压力下进行HBOT能达到最佳疗效[31]。鉴于目前研究结果的差异性,我们迫切需要更充分、有效的证据探索HBOT具体应用方案和安全性。
六、干细胞治疗
干细胞具有我更新和分化为多个细胞系的能力,由于传统治疗的局限性,基于干细胞的疗法已成为治疗神经系统疾病的理想选择。干细胞的神经保护涉及多种机制,包括细胞替代作用和旁分泌效应,参与促进神经发生、血管生成、突触发生,减少脑损伤后瘢痕形成,同时,炎症基因的下调和抗凋亡因子的参与也是干细胞发挥神经保护的基础。
1.临床前证据:HI后0～7天给予1.5×104～1×108 /kg干细胞治疗,在小鼠和大鼠模型中观察到解剖学和功能学方面的改善[36]。Inês Serrenho 等人对干细胞的临床前试验进行了荟萃分析,结果表示干细胞能改善认知、感觉及运动功能,减少脑损伤,支持干细胞治疗的潜力及与HT联合应用的可能性[37]。与前者研究一致,Robertson在新生仔猪中HI后24和48 h,给予2剂3 000万人脐带间充质干细胞联合12 h HT,结果显示联合治疗能增强HT的脑保护作用[38]。但Herz等人发现联合治疗可能导致脑损伤加重、长期功能缺陷增加[39],该研究选取的HT和干细胞治疗的剂量和时间均具有前期研究数据支持,仅在干细胞类型的选择上有所不同。由于两种治疗方案可能相互影响,联合治疗的具体应用不能单纯从前期的单药研究中摘取,进一步的治疗窗、剂量的研究仍必不可少。
2.临床证据:在脑瘫患儿中已经开展了干细胞治疗的临床研究,在原发性和晚期损伤阶段应用脐带血干细胞移植治疗均可以加速脑瘫患者的功能恢复,减少长期残疾、提高生活质量。并且重复剂量具有叠加效应,与较早时间点单次给药相比,在不同时间点多次给予脐带血细胞更好的改善感觉运动功能及神经元的数量,并减少凋亡和炎症标记物[40]。Cotten等人报道,HIE患儿生后24、48、72h接受静脉注射(1～5)×107/kg细胞联合HT,长期神经系统预后有所改善[41]。
3.给药途径、剂量、安全性:干细胞治疗的全身应用途径包括静脉和腹腔给药,但由于HI涉及全身多器官组织,全身应用可能导致损耗过多。局部给药途径包括颅内、鞘内和鼻内给药等方式。颅内给药创伤大,可能增加不良反应的风险,难以广泛实践。鞘内给药曾应用于脑瘫的干细胞输注试验中。但相较而言,鼻内给药快速有效、安全无创,有巨大的潜力,研究显示其有益效果与颅内途径和腹腔给药没有显著差异,干细胞治疗的给药时间仍在探索,早期研究多选择HI损伤后24 h作为时间点,以避免急性兴奋毒性和炎症反应,损伤0～7天后的给药在随后的研究中仍显示出解剖学和功能改善,而Uemura等人的研究则显示脑损伤后24～72 h给药较脑损伤后24 h内早期给药的疗效更好。
治疗剂量需根据具体应用的细胞类型、给药途径和时间决定。临床前研究使用的细胞剂量在1.5×104～1×108 /kg之间,1×107/kg细胞是最常见且具有神经保护作用的剂量。
干细胞的安全性在体内外试验中被广泛证实,尚无严重不良反应的报道,且脐带血接受者1年的无残疾生存率明显高于接受HT的婴儿。
综上所述,HT、Epo、Mel、稀有气体、高压氧和干细胞治疗均显示出了良好的神经保护作用,在HIE治疗中有广阔的前景。但目前仍然存在研究与临床应用的差距:首先,这些研究中最常见的问题是缺乏大样本量、多中心的高质量随机对照研究;其次部分治疗方法尽管显示出了神经保护潜力,但没有其具体机制的完整、清晰的研究,这些机制的阐明将是联合治疗的理论基础;第三,尽管部分治疗方法的研究集中于某剂量范围和时间范围内,但并没有在具体的应用时间窗、剂量、给药途径、联合应用等方面达成共识;第四,治疗方法应用于疾病的不同程度(轻度HIE)、不同胎龄、体重、甚至是性别,都可能产生疗效的差异,这可能是一个新的研究方向;最后,不同经济/医疗资源环境不仅导致治疗方法可及性的差异,还对治疗有效性可能产生影响,尤其在亚低温治疗的应用中,目前在中低收入国家内的应用显示出了不一致的结果。未来的研究需要注重疾病机制的探索,明确治疗靶点,为联合治疗和治疗适用性提供理论支撑,加强对于治疗安全性、有效性的研究,并进一步开展大规模的临床试验,确立具体临床应用方案。
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